吸附層析

LOGO（AdsorptionChromatography）綱要

概述層析法分類層析的由來(lái)與發(fā)展層析分離方法的選擇吸附層析吸附柱層析薄層層析

Key：原理、吸附劑選擇、洗脫劑選擇、操作概述一、層析的由來(lái)與發(fā)展

1901年，俄國(guó)植物學(xué)家茨維特將植物色素提取液加到裝有碳酸鈣微粒的玻璃柱子上部，繼而以石油醚淋洗柱子，結(jié)果使不同的色素在在柱中得到分離而形成不同顏色的譜帶?；旌仙赝ㄟ^(guò)碳酸鈣微粒被分離成不同色帶的現(xiàn)象，像一束光線通過(guò)棱鏡時(shí)被分離成不同色帶的光譜現(xiàn)象一樣。1906年在一篇論文中將這種方法正式命名為色譜法，色譜法由此得名。1931Kuhn,Lederer用氧化鋁和碳酸鈣分離a-、b-和g-胡蘿卜素。使色譜法開始為人們所重視。1938Izmailov,Shraiber最先使用薄層色譜法。1938Taylor,Uray用離子交換色譜法分離了鋰和鉀的同位素。1941Martin,Synge提出色譜塔板理論；發(fā)明液-液分配色譜；預(yù)言了氣體可作為流動(dòng)相（即氣相色譜）。1944Consden等發(fā)明了紙色譜。

1、原理

色譜法(Chromatography），也稱色層法或?qū)游龇?后文中我們稱之為層析法）。此種方法基于混合液中各組分的分子極性、分子大小與形狀、吸附力、親和力等物理化學(xué)性質(zhì)的差異，導(dǎo)致各組分在流動(dòng)相和固定相之間的分配系數(shù)不同，組分在兩相間進(jìn)行連續(xù)多次分配，從而彼此分離。

層析不只是分離技術(shù)，也是一種分析方法。2、層析過(guò)程逆流分溶原理示意圖物質(zhì)Y(Kd=1)的分配情況溶劑A物質(zhì)Z(Kd=3)的分配情況溶劑B總量總量總量總量總量總量平衡后轉(zhuǎn)移1轉(zhuǎn)移2轉(zhuǎn)移3分溶管號(hào)轉(zhuǎn)移4上相轉(zhuǎn)移下相轉(zhuǎn)移上相轉(zhuǎn)移管中蛋白質(zhì)總量物質(zhì)Y物質(zhì)Z分溶曲線管號(hào)有效分配系數(shù)（Keff）

某一物質(zhì)在A相中的總量某一物質(zhì)在B相中的總量二、層析法分類1、按兩相物理狀態(tài)分類：

用氣體作流動(dòng)相—?dú)庀鄬游?用液體作流動(dòng)相—液相層析 固定相可以是液體或固體，便可組合成四種主要層析類型：氣－固層析（gas-solidchromatography,GSC）氣－液層析（gas-liquidchromatography,GLC）液－固層析（liquid-solidchromatography,LSC)液－液層析（liquid-liquidchromatography,LLC）2、按固定相的形態(tài)分類（1）柱層析(columnchromatography) 固定相裝在柱內(nèi)即為層析柱，根據(jù)層析柱的尺寸，結(jié)構(gòu)和制備方法不同，分為填充柱層析和毛細(xì)管或開管柱層析。（2）平板層析(planarchromatography) 固定相呈平板狀，包括薄層層析、薄膜層析和紙層析。固定相以均勻薄層涂敷在玻璃板、塑料板或有機(jī)薄膜上，或?qū)⒐潭ㄏ嘀苯又瞥杀“鍫?，稱為薄層層析(TLC)；用濾紙作為固定相或固定相載體的層析為紙層析(PC)。

（3）離子交換層析（ion-exchangechromatography）（4）凝膠層析（gelchromatography）（5）親和層析（affinitychromatography）三、層析分離方法的選擇1.對(duì)于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物大分子，由于它們分子量大、易失活以及具有生物專一和親合性等特點(diǎn)，選用多糖基質(zhì)（如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等）離子交換層析、疏水作用層析、凝膠層析和親合層析等；2.對(duì)于生物小分子的代謝物，由于它們分子量小、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)比較穩(wěn)定、操作條件不太苛刻，采用吸附、分配和離子交換層析進(jìn)行分離較為適宜。

3.氨基酸、有機(jī)酸、核苷酸等一些離子型化合物的生產(chǎn)多用離子交換層析分離；

4.抗生素、生物堿、萜類、色素等次級(jí)代謝產(chǎn)物多采用吸附層析或反相分配層析分離。3.分配系數(shù)和遷移率吸附層析示意圖吸附劑易吸附分子不易吸附分子二、示意圖第一節(jié)吸附柱層析

流動(dòng)相流過(guò)時(shí)各組分會(huì)以不同的速率向下移動(dòng)，吸附弱的組分以較快的速率向下移動(dòng)。隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，在新接觸的固定相表面上又依這種吸附-溶解過(guò)程進(jìn)行新的分配，新鮮流動(dòng)相流過(guò)已趨平衡的固定相表面時(shí)也重復(fù)這一過(guò)程，結(jié)果是吸附弱的組分隨著流動(dòng)相移動(dòng)在前面，吸附強(qiáng)的組分移動(dòng)在后面，吸附特別強(qiáng)的組分甚至?xí)浑S流動(dòng)相移動(dòng)，各種化合物在色譜柱中形成帶狀分布，實(shí)現(xiàn)混合物的分離。一、原理吸附柱層析成敗的關(guān)鍵是選擇合適的吸附劑、洗脫劑和操作方式。二、吸附劑的選擇常用的吸附劑有極性的和非極性的兩種。羥基磷灰石、硅膠、氧化鋁和人造沸石屬前者，活性炭屬后者。在實(shí)踐中不論選擇那種類型的吸附劑，都應(yīng)具備表面積大、顆粒均勻、吸附選擇性好、穩(wěn)定性強(qiáng)和成本低廉等性能。

柱層析硅膠變色硅膠（也稱藍(lán)膠）是以具有高活性吸附材料細(xì)孔硅膠為基礎(chǔ)原料經(jīng)過(guò)深加工制成的細(xì)孔硅膠為無(wú)色或微黃色透明狀玻璃體，它的基本質(zhì)量參數(shù)如下：平均孔距2.0-3.0MM2.氧化鋁

氧化鋁可能帶有堿性（因其中可混有碳酸鈉等成分），對(duì)于分離一些堿性中草藥成分，如生物堿類的分離頗為理想。但是堿性氧化鋁不宜用于醛、酮、醋、內(nèi)酯等類型的化合物分離。因?yàn)橛袝r(shí)堿性氧化鋁可與上述成分發(fā)生次級(jí)反應(yīng)，如異構(gòu)化、氧化、消除反應(yīng)等?；钚匝趸X

氧化鋁空心球

氧化鋁粉高溫氧化鋁氧化鋁絲

3.羥基磷灰石

性質(zhì)穩(wěn)定、吸附容量大、適用范圍廣。三、洗脫劑的選擇

洗脫劑指的是能夠驅(qū)使固定相中的有效成分和部分雜質(zhì)沿一定方向有規(guī)律移動(dòng)，并能夠使有效成分與其他組成物分開的緩沖液。通常它們也是溶解被吸附樣品和平衡固定相的緩沖液。合適的洗脫劑應(yīng)符合下列條件：①純度較高；②穩(wěn)定性好；③能較完全洗脫所分離的成分；④黏度?。虎菀缀退枰某煞址珠_。四、操作

柱層析的設(shè)備主要有層析柱、部分收集器、磁力攪拌器和恒流泵。有條件時(shí)，配置一臺(tái)檢測(cè)儀和一臺(tái)記錄儀就構(gòu)成一個(gè)完整的層析系統(tǒng)。（1）我們先把吸附劑裝在玻璃柱中（吸附劑用量為分離樣品的30～50倍），使它形成層析柱；（2）將待分離的樣品從柱頂加入（加樣時(shí)避免沖動(dòng)基質(zhì)）；（3）當(dāng)樣品溶液全部流入吸附層析住后，加入洗脫劑。2、流速與分離效果流速太慢，前峰拖尾與后峰相連流速太快，組分分不開正常的流速使組分完全分離

為了獲得滿意的分離結(jié)果，洗脫液的流速務(wù)必恰當(dāng)控制。如果太快，洗脫物在兩相中的平衡過(guò)程不完全；如果太慢，洗脫物會(huì)擴(kuò)散。若峰與峰之間有重疊，宜降低洗脫劑的離子強(qiáng)度，若峰間距離過(guò)大，或某些成分不能洗脫時(shí)，宜加大洗脫劑的強(qiáng)度(極性)，成分復(fù)雜時(shí)，可采用洗脫劑由弱到強(qiáng)的梯度洗脫(方法屬于離子交換層析)。

由層析柱分離出的樣品經(jīng)濃縮或凍干處理后，可進(jìn)行純度測(cè)定。如雜質(zhì)含量仍大時(shí)，應(yīng)該用其它方法繼續(xù)純化。第二節(jié)薄層層析 將吸附劑在玻璃或滌綸膠片片基上均勻涂布成薄膜或薄板，經(jīng)過(guò)活化后，即可對(duì)樣品進(jìn)行展層，達(dá)到分離、純化、制備、分析鑒定的目的。一、原理：二、吸附劑的選擇

硅膠：略帶酸性，適合于酸性和中性物質(zhì)的分離。 氧化鋁：微堿性，適合于堿性和中性物質(zhì)的分離。三、薄層板的制備薄層板常用的制作方法有：

1、浸涂法：將玻璃板在調(diào)好的支持劑漿液中浸一下，使?jié){液在玻璃板上形成薄層。2、噴涂法：用噴霧器將調(diào)好的漿液噴在玻璃板上，形成薄層。

3、傾斜涂布法：將調(diào)好的支持劑漿液倒在玻璃板上，然后將玻璃板前后左右傾斜，使支持劑漫布于整塊玻璃板上而形成薄層。4、推鋪法：在一根玻璃棒的兩端適當(dāng)距離處分別繞幾圈膠布條，膠布條的圈數(shù)視所需薄層厚度而定，然后把準(zhǔn)備好的支持劑倒在玻璃板上，用玻璃棒壓在玻璃板上，將支持劑均衡地向一個(gè)方面推動(dòng)，而制成薄層。

薄層板涂好后，讓其自然干燥后方能使用。若為吸附薄層層析，制好板后還需加熱活化，目的是使其減少水分而具有一定有吸附能力。（1）薄層的厚度與Rf值

薄層厚度<200μM，Rf隨厚度增加而減少

薄層厚度>200μM，Rf基本不變（2）薄層的活化 100?C,1h （3）薄層的活性測(cè)定硅膠薄層薄板的活性測(cè)定蘇丹黃、蘇丹紅、靛酚藍(lán)在活化的薄層薄板上的層析行為ABCD（3）薄層的活性測(cè)定四、展層劑的選擇1、種類 單一溶劑、混合溶劑2、要求

使樣品組分很好地溶解

與樣品不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)

將混合樣品較好分離

易揮發(fā)、粘度小、組成簡(jiǎn)單

臨時(shí)新配，只使用一次

展層劑的極性 在同一支持介質(zhì)上，溶劑極性愈大，對(duì)同一化合物的洗脫能力也愈大，即在薄板上被推進(jìn)得愈遠(yuǎn)，Rf值愈大。不同展層劑對(duì)物質(zhì)的分離影響咖啡酸與綠原酸在極性不同的展層劑中的分離效果五、操作1、制備薄層板2、點(diǎn)樣：點(diǎn)樣斑點(diǎn)小，點(diǎn)樣量適當(dāng)3、展層：在展層劑中使組分分層4、顯色：薄層層析展開后，如果樣品本身有顏色，就可直接看到斑點(diǎn)所在位置。

若是無(wú)色物