實時熒光定量PCR技術的

原理、應用及實踐(RealtimeQuantitativePCR)RealtimeQuantitativePCR

基本原理Companyname基本原理CompanynameReal-timeqPCR的定量原理2Real-timeqPCR的檢測方法3Real-timeqPCR的基本概念1Real-timeqPCR的解析方法4Real-timeqPCR的計算方法5PCR：基本原理Denaturation:94–96°CAnnealing:50–65°CExtension:70–75°C基本要素：

TemplatePrimersDNApolymerasedNTP,N=A,G,CorTCompanyname

與普通PCR的比較S形曲線，具有平臺效應終點檢測法反應效率差異的累積使終點定量幾乎不可能不同濃度的起始模板經(jīng)PCR擴增后到達某一定值時所需要的循環(huán)數(shù)來計算起始模板量

定量原理Companyname理想的PCR反應：

X=X0*2n實際的PCR反應：

X=X0(1+Ex)nn：擴增反應的循環(huán)次數(shù)

X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量

X0：初始模板量

Ex：擴增效率Companyname

每個模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，起始拷貝數(shù)越多，CT值越小。確定初始模板的濃度

定量原理Ct=-klogX0+b

real-time

qPCR

使確定模板初始數(shù)量成為可能11實時熒光定量PCR中的三個概念1擴增曲線

(primarycurve)2熒光閾值（threshold)3CT值(CycleThreshold)Companyname熒光閾值（threshold)是在擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在PCR反應指數(shù)擴增階段任意位置上，但一般熒光域值的缺省設置是PCR反應前3-15個循環(huán)熒光信號標準偏差的10倍。閾值線原則：1）要大于樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值；2）同時要盡量選擇進入指數(shù)期的最初階段CT值(CycleThreshold)CompanynameCt值的定義：

PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)C(t)valueCompanynameCt值的特點：相同模板進行96次擴增，終點處產(chǎn)物量不恒定；

Ct值則極具重現(xiàn)性17

解析方法2標準曲線分析1融解曲線分析3絕對定量和相對定量Companyname將溫度對熒光強度的變化求導。(-dI/dT)Tm值確認PCR反應的特異性融解曲線分析Companyname融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準確融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準確融解曲線分析

已知基因拷貝數(shù)的標準品建立標準曲線關鍵：DNA的精確定量絕對定量Sample2522相對定量表達量校正樣品量內(nèi)參beta-actin、GAPDH基因、rRNA等看家基因在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響較小目的基因/內(nèi)標基因，均一化為每個細胞或基因組對應的目的基因數(shù)量以各自樣本中內(nèi)參基因為標準，比較不同樣本中目的基因的相對表達豐度23相對定量的數(shù)據(jù)處理ΔCtΔΔCtPfafflModificationVandesompeleMethod非均一化的需要后續(xù)的均一化以內(nèi)參基因作為標準目標樣品的相對定量通過內(nèi)參基因的相對定量進行均一化只有一個內(nèi)參基因假設擴增效率為100%擴增效率不同只有一個內(nèi)參基因擴增效率不同多個內(nèi)參基因簡單復雜ΔΔCt存在的問題Companyname成立條件：假設擴增效率為100%滿足條件：1）內(nèi)參基因和目標基因的擴增效率接近2）內(nèi)參基因和目標基因的擴增效率為90%-110%相對定量方法實驗流程Companyname樣本處理與RNA提取外界刺激

–

–可檢測的表達改變樣品離開定義環(huán)境–

–裂解、固定細胞Trizon裂解液（氰酸胍，異硫氰酸呱，SDS）液氮RNA保存液小心DNA污染！使用DNase以RNA作PCR陰性對照

CW0580

CW0592逆轉錄逆轉錄引物選擇下游應用：是否檢測其它基因？AbundantRNA的干擾：mRNAortotalRNA？檢測靈敏度是否足夠？是否會有二級結構干擾？一步法還是兩步法？兩步法：步驟多但靈活多樣。cDNA可長期保留檢測多個基因。便于反應優(yōu)化。推薦：工作的初期階段

RealSYBR二步法熒光定量PCR試劑盒/WithROX

RealSYBR一步法熒光定量PCR試劑盒/WithROX

RealSuper二步法熒光定量PCR試劑盒/WithROX一步法：簡便、快捷但只做一個基因，一旦失敗難以查找原因。推薦：工作的成熟階段

RealSuper一步法熒光定量PCR試劑盒/WithROX

Mastermix的優(yōu)化

Hotstar化學修飾，低溫下酶活抑制強，熱復活需10分鐘FastHotstar抗體或oligo修飾，熱復活僅需幾十秒CW0696CW0704熱啟動DNA聚合酶反應條件優(yōu)化內(nèi)參基因單一特異性產(chǎn)物反應效率90%-110%反應條件優(yōu)化目的基因單一特異性產(chǎn)物反應效率接近內(nèi)參基因反應效率盡量高

內(nèi)參基因

高豐度

ACTB，GAPDH中等豐度

beta2M低豐度

HPRT136擴增產(chǎn)物設計原則二級結構頸環(huán)結構片段長度75-200bp最佳長度80-120bp有限的二級結構二級結構的預測用mFold引物避免位于頸環(huán)結構上總原則與普通PCR相同二級結構Companyname擴增產(chǎn)物的二級結構引物避免位于頸環(huán)結構上

Companyname引物的位置Companyname55℃60℃65℃溫度對二級結構的影響Companyname實踐Companyname實踐內(nèi)參基因的標準曲線的繪制與數(shù)據(jù)分析Companyname樣本：293T細胞株人提取方法：TrizonRNA提取試劑

CWBIO公司CW0580說明書2×106

個細胞總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖RNA提取Companyname逆轉錄：HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒CWBIO公司CW0744說明書取5ul擴增產(chǎn)物，用1.7%瓊脂糖凝膠進行電泳體系：2×TaqMasterMix10ulGAPDHF引物（10um）0.5ulGAPDHR引物（10um）0.5ulcDNA1u加入滅菌水至20ul。逆轉錄Companyname模板cDNA模板稀釋倍數(shù)10000倍1000倍100倍10倍引物內(nèi)參基因引物模板反應體系的配置cDNA模板2.0μl正向引物F(10μM)0.5μl反向引物R

(10μM）0.5μlREALSYBRMixture(2×)10.0μlddH2O7.0μlTotal20.0μlCompanyname注意：1、為了避免加樣誤差，做預混體系

2、充分混勻，如有氣泡短暫離心Companyname95℃5min95℃10-15sec60℃20-30secPlatereadGoto2for39cyclesmoreMeltingcurveanalysis:from72℃to95℃,readevery0.2℃,hold1secbetweenreadsEndTm值：DNA解鏈一半時的溫度