豬瘟耐熱活疫苗和豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗的免疫與檢測

xxx2012.06.10

一、免疫程序定義：一個(gè)地區(qū)(或單位)根據(jù)實(shí)際情況制定的合理的預(yù)防接種計(jì)劃。即依據(jù)疫病在本地區(qū)流行情況及規(guī)律，畜禽的用途、年齡、母源抗體水平和飼養(yǎng)條件，使用疫苗的種類、性質(zhì)、免疫途徑豬病免疫對象疫苗免疫時(shí)間豬瘟仔豬小豬公、母豬豬瘟耐熱活疫苗常發(fā)場哺乳前免疫(免疫前后1小時(shí)才能哺乳)21-28日齡首次免疫60日齡第二次免疫每年春秋各免疫一次豬繁殖與呼吸道系統(tǒng)綜合癥又稱：藍(lán)耳病所有豬群豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗生產(chǎn)母豬、小豬斷奶前后肌注,后備母豬配種前一個(gè)月肌注1、ELISA的發(fā)展過程

關(guān)于ELISA,1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann,荷蘭學(xué)者VanWeerman和Schuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測定法。ELISA現(xiàn)在已成為目前分析化學(xué)領(lǐng)域中的前沿課題，它是一種特殊的試劑分析方法，是在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術(shù)2、ELISA方法的優(yōu)點(diǎn)1、檢測靈敏度高，可達(dá)到ug/kg或ng/kg水平2、特異性強(qiáng)：抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)ELISA試驗(yàn)以靈敏度較高、特異性較好的特點(diǎn)在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用，但操作中的各個(gè)環(huán)節(jié)對試驗(yàn)的檢測效果影響較大，如不注意，有可能導(dǎo)致顯色不全、花板等結(jié)果3、對儀器設(shè)備要求不高，測定成本較低。4、方法快速、簡便5、自動化程度高6、試劑保存時(shí)間較長7、方法種類較多8、無放射性同位數(shù)污染二、實(shí)驗(yàn)步驟1、采樣該過程已由通威公司人員操作完成。2、實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備通過查找資料確定實(shí)驗(yàn)步驟，對實(shí)驗(yàn)過程中的試劑用量進(jìn)行計(jì)算。準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)所需要的儀器設(shè)備以及所需要各種試劑。

96孔板

對孔板進(jìn)行標(biāo)號（7）、Pbst的配制（8）、配制二抗（9）、加二抗（10）、底物的配制（11）、加反應(yīng)底物（12）、加終止液，反應(yīng)停止（13）、用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測（1）、抗原的稀釋用電子天枰稱取1-2g抗原，加入一定的已經(jīng)配制好的pbs溶液，將抗原稀釋成2mg/ml的稀釋溶液，取兩個(gè)已經(jīng)洗好的小燒杯，向其中加入20ml的pbs溶液，再從已經(jīng)配制好的2mg/ml的抗原稀釋液取出200ul，加入到小燒杯中，將抗原溶液再稀釋100倍，配制成所需要的抗原稀釋液。（2）、抗原包被取出已經(jīng)準(zhǔn)備好的ELISA板，96孔板按照標(biāo)準(zhǔn)100/well進(jìn)行包被，用移液管吸取100ul加入到孔板的每一個(gè)孔當(dāng)中在最后兩列的倒數(shù)第三孔不加稀釋液，留做對照。將已經(jīng)加好的孔板放入到37攝氏度的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行反應(yīng)2h。（4）、對孔板進(jìn)行封閉用PBS溶液洗版一次對孔板的封閉，是對整個(gè)孔沒有結(jié)合抗原的部分進(jìn)行封閉，就是用4%的pbsm填充整個(gè)小孔。然后將孔板放入37攝氏度的恒溫箱中靜置，反應(yīng)1h。（5）、一抗的配制根據(jù)前面預(yù)實(shí)驗(yàn)的檢測與分析，檢測抗體時(shí)血清的最佳稀釋濃度稀釋比例應(yīng)該在1:40合適，因此在這里采用稀釋40倍的比例進(jìn)行一抗的反應(yīng)。用PBSM溶液將已經(jīng)用甘油稀釋2倍的血清溶液稀釋到40倍注意：從冰箱中取出血清溶液，必須將血清放在低溫下，然后操作，這就需要將血清放在冰里面進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在吸取不同的血清時(shí)，應(yīng)當(dāng)使用不同的槍頭，防止交叉污染。（6）、加一抗當(dāng)時(shí)間到了1h時(shí)，取出孔板，用pbs洗版一次，從培養(yǎng)箱中取出孔板，用已經(jīng)配好的pbs溶液洗版一次，然后將孔板放拍打在衛(wèi)生紙上，將其中的能夠拍打出來的液體拍出。然后用移液管吸取已經(jīng)配制好的一抗溶液按照準(zhǔn)備階段所設(shè)計(jì)的加血清方案進(jìn)行加樣，每孔100ul。加滿以后放置37攝氏度的恒溫箱中培養(yǎng)，1h。（8）、配制二抗本實(shí)驗(yàn)使用的二抗是兔抗豬，查閱兔抗豬產(chǎn)品的說明書，本產(chǎn)品最適稀釋比例為1:1000-1:5000。根據(jù)說明書以及通過老師經(jīng)驗(yàn)確定二抗稀釋度為：1：2000的稀釋比例。用pbsm溶液將二抗稀釋到1:2000（9）、加二抗用pbst和pbs分別洗板兩次，然后在衛(wèi)生紙上拍板，然后用移液槍向孔板的每一個(gè)孔中加入已經(jīng)配制好的二抗溶液，用移液槍吸取100ul加入到每一個(gè)孔當(dāng)中，注意對照中，不加二抗的兩孔用pbsm代替。加完二抗，將其放入37攝氏度的恒溫箱中反應(yīng)1h（10）、底物的配制底物采用TMB反應(yīng)底物，用電子天枰稱取6mg的TMB，加入到1.5ml的ep管中，用移液管吸取1ml的DMSO加入到裝有TMB得ep管中，讓TMB溶解，待用。取一個(gè)燒杯，想其中加入45.5ml的水和4.5ml的醋酸鈉溶液，再從ep管中吸取450ulTMB和DMSO的混合溶液加入到燒杯當(dāng)中，再向燒杯中加入18ul的雙氧水，配制成反應(yīng)底物。注意，加入雙氧水和向孔板中加入反應(yīng)底物的時(shí)間不能太長。（12）、加終止液，反應(yīng)停止當(dāng)反應(yīng)過程中，取一個(gè)小燒杯，向其中倒入一定量的2M的硫酸溶液，待用。當(dāng)避光反應(yīng)20分鐘后，拿出孔板，觀察顏色的變化，若藍(lán)色變化明顯，且不同的樣品有顏色的深淺，就進(jìn)行下一步的操作，如果藍(lán)色很淺，甚至看不出有顏色，就讓其放入避光出再反應(yīng)幾分鐘，然后進(jìn)行下一步的操作，符合顏色變化以后以后，用移液槍吸取已經(jīng)準(zhǔn)備好的硫酸溶液25ul加入到孔板的每一個(gè)孔中，終止反應(yīng)。（13）、用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測加終止液前，將酶標(biāo)儀開關(guān)打開，讓酶標(biāo)儀預(yù)熱，待用。將孔板放入酶標(biāo)儀當(dāng)中，在OD450nm下測定吸光度值。用電腦輸出檢測數(shù)據(jù)，計(jì)算效價(jià)。2號豬場商品豬號12345678910陽性比例豬瘟耐熱+++---++++70%繁與呼綜合

-+--++-+-+50%3號豬場商品豬號1234陽性比例豬瘟耐熱++-+75%繁與呼綜合

++++100%商品豬號123456789陽性比例豬瘟耐熱+++-+++++89%繁與呼綜合

++++-+++-78%5、結(jié)果分析本實(shí)驗(yàn)采用ELISA方法檢測豬血清中抗血清效價(jià)的測定，抗原（疫苗）直接包被ELISA板，抗血清（樣品）與包被的抗原相互作用，再用二抗（兔抗豬IgG/HRP）進(jìn)行檢測并顯色。檢測結(jié)果中，抗血清效價(jià)低于1:40的被認(rèn)為是免疫失敗。從不同豬場來分析，三個(gè)豬場的免疫效果基本