凝膠過濾層析法聚丙烯酰胺凝膠電泳

蛋白質(zhì)分離純化及鑒定凝膠過濾層析法試驗原理

利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小不同來進(jìn)行分離。Kd=(Ve-Vo)/Vi優(yōu)點條件溫和操作簡便損失少回收率高層析柱可反復(fù)使用凝膠及凝膠柱的選擇根據(jù)不同分子量選擇不同凝膠Sephadex:交聯(lián)葡聚糖G-10，15，25，50，75，100，150，200；得水值X10Sepharose：瓊脂糖凝膠Bio-GelABio-GelP：聚丙烯酰胺凝膠分子篩Sephacryl：用N，N-亞甲雙丙烯酰胺交聯(lián)的葡聚糖凝膠凝膠的前處理溶脹：稱取適量凝膠干粉，用約10倍蒸餾水浸泡24小時以上，待凝膠充分溶脹后，傾去上層懸浮物及蒸餾水。堿洗：用0.5MNaOH

溶液浸泡半個小時，然后用蒸餾水洗至中性。酸洗：用0.5MHCl

溶液浸泡半個小時，然后用蒸餾水洗至中性。平衡：用起始緩沖液浸泡凝膠，直至凝膠液pH與起始緩沖液相同。將層析柱垂直固定，加入適量溶劑排走空氣。將平衡好的凝膠攪勻，連續(xù)傾入柱中，待其自然沉降至1/4~1/3高時打開下端出口，讓溶劑慢慢流出，繼續(xù)侵入凝膠至沉降到所需高度。裝柱時要注意操作壓。用3-5倍柱床體積的起始緩沖液走柱，使交換劑充分平衡，柱床穩(wěn)定。

裝柱樣品上柱、洗脫、收集。

如圖裝好層析裝置，打開下端出口，使溶液流出至剛好達(dá)到凝膠膠面沿柱壁緩慢加入2ml樣品，打開下端出口，使樣品溶液流出至剛好達(dá)到凝膠膠面，再取少量起始緩沖液洗滌柱壁。打開起始緩沖液閥門，連續(xù)洗脫。用自動部分收集器自動或手動收集，合并同一高峰各管。a.分離蛋白質(zhì)b.脫鹽c.蛋白質(zhì)分子量的測定應(yīng)用

聚丙烯酰胺凝膠電泳

1．原理 聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(簡稱Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(簡稱Bis)在加速劑N，N，N，N-四甲基乙二胺(簡稱TEMED)和催化劑過硫酸銨(簡稱AP)或核黃素(VB2)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(簡稱PAGE)。分子量范圍 適用的凝膠濃度/(%)

104 20-30 1-4×104 15-201-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10

5×105 2-5 分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系1.2凝膠濃度的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān)

凝膠濃度的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān)1.3種類連續(xù)系統(tǒng)與不目前常用的多為圓盤電泳(圖1)和板狀電泳(圖2)，兩者電泳原理完全相同。聚丙烯酰胺凝膠電泳分為連續(xù)系統(tǒng)兩大類。圖1聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖

(A為正面,B為剖面)

(1)樣品膠pH6.7(2)濃縮膠pH6.7

(3)分離膠pH8.9(4)電極緩沖液pH8.3

圖3蛋白質(zhì)微型電泳系統(tǒng)蛋白質(zhì)微型電泳系統(tǒng)1.4不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HC1。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9Tris-HC1。電極緩沖液是pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。樣品濃縮效應(yīng)

A.凝膠孔徑不連續(xù)性

B.緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性

C.電位梯度的不連續(xù)性分子篩效應(yīng)電荷效應(yīng)1.5不連續(xù)體系凝膠對蛋白的分離作用2.2樣品處理適量濃度蛋白溶液加入1×上樣緩沖液混勻，95℃水浴中處理5分鐘。

2.3加樣

用微量進(jìn)樣器取10-15l上述混合液，通過電極緩沖液，小心地將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部。2.4電泳將電泳儀的正極與下槽連接，負(fù)極與上槽連接，打開電泳儀開關(guān)，開始時電流為10mA，待樣品進(jìn)入分離膠后，將電流調(diào)至20-30mA，當(dāng)溴酚藍(lán)染料距硅膠框1cm時，停止電泳，關(guān)閉電源。2.5染色與脫色

電泳結(jié)束后，取下凝膠模，卸下膠框，用凝膠鏟小心撬開短玻璃板，從凝膠板上切下一角作為加樣標(biāo)記，在兩側(cè)溴酚藍(lán)染料區(qū)帶中心，加入染色液染色1-2h，再用脫色液脫色，直至蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰，即可計算相對遷移率2.6結(jié)果處理各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與加樣端的距離(cm)，按下式計算相對遷移率mR: