工業(yè)用微生物菌種課用第1頁(yè)/共108頁(yè)第二章發(fā)酵工業(yè)菌種第2頁(yè)/共108頁(yè)本章內(nèi)容

一、常用的工業(yè)微生物二、發(fā)酵工業(yè)菌種篩選的原則與基本技術(shù)三、發(fā)酵工業(yè)菌種改良第3頁(yè)/共108頁(yè)最常用的工業(yè)微生物細(xì)菌醋酸桿菌屬制醋工業(yè)的菌種乳酸桿菌枯草桿菌丙酮丁醇梭菌大腸桿菌谷氨酸棒狀桿菌假單胞菌第4頁(yè)/共108頁(yè)第5頁(yè)/共108頁(yè)第6頁(yè)/共108頁(yè)第7頁(yè)/共108頁(yè)第8頁(yè)/共108頁(yè)熒光假單胞菌熒光假單胞菌(P.fluorescens)屬于假單胞菌屬rRNAI群熒光DNA同源組，是植物根際最普遍的微生物類群，具有分布廣、數(shù)量多、營(yíng)養(yǎng)需要簡(jiǎn)單、繁殖快、競(jìng)爭(zhēng)定殖力強(qiáng)的特點(diǎn)。熒光假單胞菌，而且許多菌株能產(chǎn)生幾種活性物質(zhì)，抗多種植物病害。其作用機(jī)制包括：抗生素的作用、噬鐵素對(duì)鐵的營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、有效的根際定殖等。世界許多國(guó)家均有人報(bào)道分離到抗植物病害的熒光假單胞菌,而且許多菌株能產(chǎn)生幾種活性物質(zhì),如抗油菜菌核病的菌株。第9頁(yè)/共108頁(yè)第10頁(yè)/共108頁(yè)銅綠假單胞菌（綠膿桿菌）第11頁(yè)/共108頁(yè)第12頁(yè)/共108頁(yè)第13頁(yè)/共108頁(yè)第14頁(yè)/共108頁(yè)谷氨酸發(fā)酵菌種日前用于谷氨酸發(fā)酵的菌種有谷氨酸棒桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌、黃色短桿菌、嗜氨小桿菌、球形節(jié)桿菌。我國(guó)常使用的生產(chǎn)菌株是北京棒桿菌AS1.299、北京棒桿菌D110、鈍齒棒桿菌A51.542、棒桿菌S-914和黃色短桿菌T6~T13等。在己報(bào)道的谷氨酸生產(chǎn)菌中，除芽孢桿菌外，雖然它們?cè)诜诸悓W(xué)上屬于不同的屬種，但都有一些共同的特點(diǎn)，如菌體為球形、短稈至棒狀、無(wú)鞭毛、不運(yùn)動(dòng)、不形成芽孢、呈革蘭氏陽(yáng)性、需要生物素做生長(zhǎng)因子、在通氣條件下培養(yǎng)產(chǎn)生谷氨酸。第15頁(yè)/共108頁(yè)谷氨酸發(fā)酵機(jī)制谷氨酸的生物合成途徑大致是：葡萄糖經(jīng)EMP途徑或HMP途經(jīng)生成丙酮酸→再氧化成乙酰輔酶A→然后進(jìn)入TCA→再通過(guò)乙醛酸循環(huán)、CO2固定作用→生成a-酮戊二酸→谷氨酸脫氫酶的催化及有NH4+存在的條件下生成谷氨酸第16頁(yè)/共108頁(yè)谷氨酸生產(chǎn)菌能夠在體外積累菌體最大生長(zhǎng)需要量300多倍的谷氨酸，研究發(fā)現(xiàn)：大量積累并非是當(dāng)初設(shè)想的由于特異代謝途徑導(dǎo)致，而是：代謝調(diào)節(jié)控制；細(xì)胞膜通透性的特異調(diào)節(jié)；發(fā)酵條件的適合。第17頁(yè)/共108頁(yè)谷氨酸菌種的定向選育改變細(xì)胞膜的通透性：生物素（乙酰CoA羧化酶的輔酶）營(yíng)養(yǎng)缺陷型株喪失脂肪酸合成酶的油酸缺陷型；喪失a-磷酸甘油酶的甘油缺陷型。選育溫度敏感突變株：例：使用典型的溫度敏感突變株TS-88生產(chǎn)谷氨酸時(shí)，通過(guò)控制發(fā)酵條件，在生長(zhǎng)適當(dāng)階段將發(fā)酵溫度由30℃提高到40

℃，可在生物素含量為33ug/L，含糖3.6%的甜菜糖蜜發(fā)酵培養(yǎng)基中，產(chǎn)生20g/L谷氨酸，對(duì)糖轉(zhuǎn)化率>55%。第18頁(yè)/共108頁(yè)生物素對(duì)谷氨酸發(fā)酵的影響生物素作為催化脂肪酸生物合成最初反應(yīng)的關(guān)鍵酶——乙酰CoA羧化酶的輔酶，參與了脂肪酸的生物合成，進(jìn)而影響磷脂的合成。當(dāng)控制生物素在亞適量時(shí)，脂肪酸合成就不完全，導(dǎo)致磷脂合成不完全。而細(xì)胞膜是由磷脂雙分子層組成的，當(dāng)磷脂含量減少到正常時(shí)的一半左右時(shí)，細(xì)胞發(fā)生變形，谷氨酸能夠從胞內(nèi)滲出、積累于發(fā)酵液中。如果生物素過(guò)量，則發(fā)酵過(guò)程菌體大量繁殖，不產(chǎn)或少產(chǎn)谷氨酸，代謝產(chǎn)物中乳酸和琥珀酸明顯增多。第19頁(yè)/共108頁(yè)生物素亞適量的原因（2ug/L~5ug/L）

：當(dāng)生物素缺乏時(shí)，菌種生長(zhǎng)十分緩慢；當(dāng)生物素過(guò)量時(shí)，則轉(zhuǎn)為乳酸發(fā)酵。在谷氨酸發(fā)酵過(guò)程中，影響菌種代謝途徑的因素見下表。第20頁(yè)/共108頁(yè)第21頁(yè)/共108頁(yè)第36頁(yè)，共69頁(yè)防止噬菌體和雜菌的污染谷氨酸生產(chǎn)菌一

般都是生物素缺陷型，而在發(fā)酵培養(yǎng)基中又大多是控制生物素亞適量，所以谷氨酸生產(chǎn)菌對(duì)噬菌體和雜菌的抵抗能力較弱。最怕污染噬菌體，輕則出現(xiàn)谷氨酸收率低、難提取，重則倒罐，造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。所以，雜菌和噬菌體的防治工作就顯得特別重要。一定要從空氣過(guò)濾、培養(yǎng)基、設(shè)備、環(huán)境等環(huán)節(jié)嚴(yán)格把關(guān)。第22頁(yè)/共108頁(yè)最常用的工業(yè)微生物酵母菌釀酒酵母假絲酵母屬產(chǎn)朊假絲酵母解脂假絲酵母熱帶假絲酵母畢赤酵母屬、漢遜酵母屬：酒精發(fā)酵工業(yè)及釀造工業(yè)的有害菌第23頁(yè)/共108頁(yè)1、酵母菌形態(tài)：酵母菌是一群?jiǎn)渭?xì)胞的真核微生物,其形態(tài)因種而異.通常為圓形、卵圓形或橢圓形。也有特殊形態(tài)，如檸檬形、三角形、藕節(jié)狀、臘腸形，假菌絲等。酵母菌第24頁(yè)/共108頁(yè)假菌絲:酵母菌在一定條件下培養(yǎng)，產(chǎn)生的芽體與母細(xì)胞不分離形成的特殊形態(tài)。第25頁(yè)/共108頁(yè)啤酒酵母的菌落紅酵母的菌落各種酵母菌的菌落第26頁(yè)/共108頁(yè)酵母菌菌落第27頁(yè)/共108頁(yè)最常用的工業(yè)微生物霉菌曲霉屬米曲霉黑曲霉青霉屬青霉菌：點(diǎn)青霉、產(chǎn)黃青霉桔青霉根霉屬德氏根霉米根霉、小麥曲根霉紅曲霉屬紫紅曲霉第28頁(yè)/共108頁(yè)第29頁(yè)/共108頁(yè)第30頁(yè)/共108頁(yè)最常用的工業(yè)微生物放線菌鏈霉菌屬小單孢菌屬地中海諾卡氏菌米蘇里游動(dòng)放線菌第31頁(yè)/共108頁(yè)第32頁(yè)/共108頁(yè)第33頁(yè)/共108頁(yè)第34頁(yè)/共108頁(yè)

未培養(yǎng)微生物定義：指迄今所采用的微生物純培養(yǎng)分離及培養(yǎng)方法還未獲得純培養(yǎng)的微生物，其在自然環(huán)境微生物群落中占有非常高的比例，約為99％。研究方法①模擬自然培養(yǎng)法:

原位培養(yǎng)、培養(yǎng)條件優(yōu)化、單細(xì)胞操作②宏基因組分析法第35頁(yè)/共108頁(yè)二、發(fā)酵工業(yè)菌種分離篩選原則與基本技術(shù)（一）發(fā)酵工業(yè)菌種篩選的總趨勢(shì)與要求（二）分離篩選原理與技術(shù)（三）應(yīng)用舉例第36頁(yè)/共108頁(yè)

1.菌種選擇的總趨勢(shì)野生菌→變異菌自然選育→代謝控制育種誘發(fā)基因突變→基因重組的定向育種

第37頁(yè)/共108頁(yè)純凈健壯產(chǎn)量質(zhì)量穩(wěn)定2易于控制培養(yǎng)條件,周期短3對(duì)誘變劑敏感4抗污染力強(qiáng)5原料廉價(jià),生長(zhǎng)迅速,目的產(chǎn)物產(chǎn)量高6不是病原菌12、微生物工業(yè)對(duì)菌種的要求7產(chǎn)物分泌型第38頁(yè)/共108頁(yè)工業(yè)菌種的改良方法解除或繞過(guò)代謝途徑中的限速步驟：通過(guò)增加特定基因的拷貝數(shù)或增加相應(yīng)基因的表達(dá)能力來(lái)提高限速酶的含量；在代謝途徑中引伸出新的代謝步驟，由此提供一個(gè)旁路代謝途徑。增加前體物的深度。改變代謝途徑，減少無(wú)用副產(chǎn)品的生成以及提高菌種對(duì)高深度的有潛在毒物的底物、前體或產(chǎn)品的耐受力。第39頁(yè)/共108頁(yè)抑制或消除產(chǎn)品分解酶。改進(jìn)菌種外泌產(chǎn)品的能力。消除代謝產(chǎn)品的反饋抑制，如誘導(dǎo)代謝產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)類似物抗性。工業(yè)菌種的改良方法第40頁(yè)/共108頁(yè)（二）分離篩選原理與技術(shù)1.篩選的指導(dǎo)思想2.分離篩選工作在實(shí)際中應(yīng)用的幾個(gè)方面3.

新種分離篩選原理與技術(shù)第41頁(yè)/共108頁(yè)1.篩選的兩種指導(dǎo)思想

先分離純化，再結(jié)合工藝要求進(jìn)行篩選。分離純化同時(shí)富于篩選條件，一步得出所需菌株。結(jié)果有兩種可能：獲得適于工業(yè)發(fā)酵菌株只獲得選育所需的出發(fā)菌株

第42頁(yè)/共108頁(yè)2.分離篩選工作在實(shí)際中應(yīng)用的幾個(gè)方面從被污染的生產(chǎn)及科研用菌中分離目的菌；

生產(chǎn)中長(zhǎng)期使用的菌種的定期分離篩選；從各種育種方法處理的微生物材料中分離篩選適于工業(yè)目的的優(yōu)良菌株；從保藏機(jī)構(gòu)獲取菌種好處：經(jīng)濟(jì)性、指導(dǎo)性從已知菌種和大自然中分離新菌株尋找新的發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)生菌；尋找老產(chǎn)品的新的優(yōu)良菌株。第43頁(yè)/共108頁(yè)國(guó)際承認(rèn)的中國(guó)培養(yǎng)物保藏單位武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC。保藏了幾乎所有的培養(yǎng)物。(CCTCC)第44頁(yè)/共108頁(yè)國(guó)際承認(rèn)的中國(guó)培養(yǎng)物保藏單位中科院微生物研究所的中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC。保藏有普通菌種。(CGMCC)第45頁(yè)/共108頁(yè)此外，較著名的中國(guó)培養(yǎng)物保藏單位還有中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)CCCCM——管理機(jī)構(gòu)第46頁(yè)/共108頁(yè)3.新種分離與篩選的步驟

調(diào)查研究（包括資料查閱）

試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

含微生物樣品的采集

（如何使樣品中含所需微生物的可能性大？）

樣品預(yù)處理（如何在后續(xù)的操作中使這種可能性實(shí)現(xiàn)）

菌種分離

第47頁(yè)/共108頁(yè)

根據(jù)目的菌株及其產(chǎn)物特點(diǎn)分

選擇性分離方法 隨機(jī)分離方法

(定向篩選←選擇壓力)

(用篩選方案-檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行間接分離）

富集液體培養(yǎng)固體培養(yǎng)基條件培養(yǎng)

(初篩)

菌種純化

復(fù)篩

第48頁(yè)/共108頁(yè)

菌種純化初步工藝條件摸索再?gòu)?fù)篩生產(chǎn)性能測(cè)試較優(yōu)菌株1-3株保藏及進(jìn)一步做生產(chǎn)試驗(yàn)?zāi)承┍匾囼?yàn)和或作為育種的出發(fā)菌株毒性試驗(yàn)等

第49頁(yè)/共108頁(yè)（1）含微生物樣品的采集采樣時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題:土壤微生物的分布采土深度：5~25cm土壤植被情況采樣季節(jié)土壤的酸堿度對(duì)于分離篩選新菌種，還存在另兩個(gè)選擇標(biāo)準(zhǔn)：土壤來(lái)源廣泛在已適應(yīng)相當(dāng)苛刻環(huán)境壓力的微生物類群中尋找新菌種第50頁(yè)/共108頁(yè)采樣1、采樣對(duì)象以采集土壤為主。一般園田土和耕作過(guò)的沼澤土中，以細(xì)菌和放線菌為主；富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長(zhǎng)區(qū)和果園內(nèi)。采樣的對(duì)象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。細(xì)菌（108）>放線菌（107

）>霉菌（106

）>酵母菌（105

）>藻類（104

）>原生動(dòng)物（103

）第51頁(yè)/共108頁(yè)從自然界篩選第52頁(yè)/共108頁(yè)2、采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。3、采土方式：在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后，用小薩子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標(biāo)記，記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時(shí)分離。第53頁(yè)/共108頁(yè)（2）樣品的預(yù)處理目的：提高分離效率方法：物理方法：熱處理；膜過(guò)濾法；離心法化學(xué)方法：化學(xué)成分增加特定微生物的數(shù)量誘餌法：富集目的菌第54頁(yè)/共108頁(yè)膜過(guò)濾法當(dāng)樣品中菌數(shù)很低時(shí),可以將一定體積的湖水、海水或飲用水等樣品通過(guò)膜過(guò)濾器,然后將將膜轉(zhuǎn)到相應(yīng)的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng),對(duì)形成的菌落進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。第55頁(yè)/共108頁(yè)第56頁(yè)/共108頁(yè)例如：放線菌的分離篩選，培養(yǎng)基的組成原則大多數(shù)放線菌的分離培養(yǎng)是在貧脊或復(fù)雜底物的瓊脂平板上進(jìn)行的。除嗜溫性放線菌外，其他放線菌一般在培養(yǎng)4-20天內(nèi)在分離平板上緩慢形成菌落。在放線菌分離瓊脂中通常都加入抗真菌劑制霉菌素或放線菌酮，以抑制真菌的繁殖。選擇性地添加抗生素。分離瓊脂平板制備好后，一般皆應(yīng)在37℃培養(yǎng)箱中存放3天。第57頁(yè)/共108頁(yè)放線菌的分離土樣中放線菌的非選擇性分離：土樣風(fēng)干，磨碎，無(wú)菌海綿壓印土樣后壓印平板后培養(yǎng)。植物體上放線菌的分離：無(wú)菌取植物組織，干燥以減少細(xì)菌數(shù)量，剪碎植物材料后植入平板表層后培養(yǎng)。也可洗下微生物后振蕩培養(yǎng)。水中放線菌的分離：為使所要分離的放線菌的數(shù)量種類增多，一般將水樣離心或?yàn)V紙過(guò)濾，取離心沉積或?yàn)V紙表面沉積進(jìn)行系列稀釋和涂布。第58頁(yè)/共108頁(yè)次代培養(yǎng)及純化菌落形成后可根據(jù)肉眼可見的菌落形態(tài)上的差異，作初步的鑒定和區(qū)分。通過(guò)高倍放大進(jìn)行鏡檢，可了解氣生和營(yíng)養(yǎng)孢子形成情況。成功地分離出各種不同的放線菌屬及種的關(guān)鍵是所采集樣本的本身及其分離用的瓊脂培養(yǎng)基；而肉眼識(shí)別不同的生長(zhǎng)形態(tài)、從而初步地加以鑒定，在分離放線菌時(shí)顯得尤為重要。將分離平板上所形成的菌落用經(jīng)火焰灼燒滅菌的鉤形針或無(wú)菌牙簽挑取，點(diǎn)接到瓊脂平板上進(jìn)行影印培養(yǎng)，以進(jìn)一步篩選和分離。第59頁(yè)/共108頁(yè)（3）分離方法的選擇

根據(jù)目的菌有無(wú)選擇性特征來(lái)選擇分離方法菌種的營(yíng)養(yǎng)特征獨(dú)特

生長(zhǎng)特征獨(dú)特

無(wú)選擇性特征根據(jù)產(chǎn)物的特征進(jìn)行

隨機(jī)分離選擇性分離的關(guān)鍵：生長(zhǎng)培養(yǎng)條件的選擇與控制，從而實(shí)現(xiàn)定向富集篩選。選擇性分離

第60頁(yè)/共108頁(yè)A、選擇性分離原理和技術(shù)1、生長(zhǎng)條件的選擇與控制原理控制營(yíng)養(yǎng)成分

控制培養(yǎng)基酸堿度

添加抑制劑

控制培養(yǎng)溫度

控制通氣條件

2、選擇性分離技術(shù)富集液體培養(yǎng)技術(shù)固體培養(yǎng)技術(shù)施加選擇壓力，進(jìn)行定向篩選

第61頁(yè)/共108頁(yè)①富集液體培養(yǎng)增加混合菌群中所需菌株數(shù)量的一種技術(shù)技術(shù)特點(diǎn)：給混合菌群提供一些有利于目的菌株生長(zhǎng)或不利于目的菌以外的其他菌型生長(zhǎng)的條件培養(yǎng)方式分批培養(yǎng)方式：以最大比生長(zhǎng)速率（μmax）篩選，存在選擇壓力的控制、移種時(shí)間和次數(shù)等問(wèn)題連續(xù)培養(yǎng)方式：以比生長(zhǎng)速率（μ）篩選第62頁(yè)/共108頁(yè)

μ

ABS0基質(zhì)濃度對(duì)A、B兩種菌的比生長(zhǎng)速率（μ）的影響

當(dāng)S<S0時(shí)，富集什么菌株？當(dāng)S>S0時(shí)，富集什么菌株？連續(xù)培養(yǎng)方式：以比生長(zhǎng)速率μ篩選第63頁(yè)/共108頁(yè)連續(xù)富集培養(yǎng)技術(shù)分離菌株的優(yōu)點(diǎn)

分離的菌株特別適合連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程有利于分離具有某種工業(yè)生產(chǎn)特性的菌株可以篩選出能共生的穩(wěn)定混合培養(yǎng)物

第64頁(yè)/共108頁(yè)②固體培養(yǎng)技術(shù)常用于分離某些酶產(chǎn)生菌

選擇壓力：在選擇培養(yǎng)基中加入所需酶的基質(zhì)

第65頁(yè)/共108頁(yè)隨機(jī)分離原理與技術(shù)從產(chǎn)物入手，通過(guò)設(shè)計(jì)高產(chǎn)培養(yǎng)基和建立快速靈敏專一的篩選方法，從隨機(jī)分離的菌落中篩選出所需的目的菌。技術(shù)關(guān)鍵：產(chǎn)物合成條件的選擇與控制及相應(yīng)篩選方法的確定。隨機(jī)分離技術(shù)舉例

抗生素產(chǎn)生菌的篩選藥理活性化合物產(chǎn)生菌的篩選生長(zhǎng)因子產(chǎn)生菌的篩選多糖產(chǎn)生菌的篩選

第66頁(yè)/共108頁(yè)高產(chǎn)培養(yǎng)基設(shè)計(jì)的幾個(gè)原則

制備一系列的培養(yǎng)基，其中有各種類型的養(yǎng)分成為生長(zhǎng)限制因素；使用一聚合或復(fù)合形式的生長(zhǎng)限制養(yǎng)分；避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代謝物阻遏；確定含有所需的輔因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）；使用pH緩沖劑以減少pH變化；前體、促進(jìn)劑及抑制劑的采用。第67頁(yè)/共108頁(yè)抗生素產(chǎn)生菌的篩選篩選模型：試驗(yàn)菌篩選方法：鋪菌法復(fù)印平板法液體培養(yǎng)篩選

抗藥性篩選篩選模型：氨芐青霉素和β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生菌（克雷白氏菌）協(xié)同

I II無(wú)試樣時(shí)（不含棒酸時(shí)），I對(duì)II菌作用不大有試樣時(shí)（含棒酸時(shí)），I對(duì)II菌恢復(fù)藥效，棒酸抑制水解酶活性

固體培養(yǎng)篩選第68頁(yè)/共108頁(yè)試驗(yàn)菌代表微生物類型金黃色葡萄球菌209p革蘭氏陽(yáng)性球菌枯草桿菌6633 革蘭氏陽(yáng)性桿菌 大腸桿菌革蘭氏陰性腸道細(xì)菌恥垢分枝桿菌607

結(jié)核桿菌 白色念珠菌 酵母狀真菌 青霉菌

絲狀真菌

第69頁(yè)/共108頁(yè)藥理活性化合物產(chǎn)生菌的篩選

藥理活性化合物是指能抑制人類代謝中某一個(gè)關(guān)鍵酶的微生物產(chǎn)物即酶抑制劑，從而達(dá)到治療的目的。篩選模型：目標(biāo)酶第70頁(yè)/共108頁(yè)生長(zhǎng)因子產(chǎn)生菌的篩選

篩選模型：營(yíng)養(yǎng)缺陷型試驗(yàn)菌

篩選方法：利用被分離的微生物產(chǎn)物能否促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)缺陷型試驗(yàn)菌生長(zhǎng)第71頁(yè)/共108頁(yè)氨基酸產(chǎn)生菌的篩選

樣品

預(yù)處理

初篩（除真菌）

在分離平板上生長(zhǎng)獲得多個(gè)單菌落復(fù)印平板（copy法）

平板培養(yǎng)，其中有產(chǎn)生氨基酸的菌落分泌氨基酸對(duì)應(yīng)到copy前相應(yīng)

u.v線殺死長(zhǎng)好的菌落

位置，找到目的菌落

再鋪上一層含營(yíng)養(yǎng)缺陷型試驗(yàn)菌的瓊脂

培養(yǎng)后

產(chǎn)氨基酸菌落周圍有生長(zhǎng)圈

目的菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量測(cè)定篩選產(chǎn)物含量高的菌株第72頁(yè)/共108頁(yè)多糖產(chǎn)生菌的篩選取樣特點(diǎn)：碳水化合物工業(yè)的廢棄物篩選方案：從菌落外觀判斷，選擇外觀呈粘液狀的菌落，然后根據(jù)液體培養(yǎng)測(cè)定多糖含量來(lái)篩選高產(chǎn)菌。第73頁(yè)/共108頁(yè)4、幾種典型微生物的分離篩選方法舉例細(xì)菌放線菌真菌第74頁(yè)/共108頁(yè)細(xì)菌分離：以乳酸菌為例

取未成熟的醬醪樣品1g至無(wú)菌磨口瓶中

加麥芽汁至瓶口處，封塞，25℃培養(yǎng)24-48h培養(yǎng)基中長(zhǎng)出絹絲狀波動(dòng)物，鏡檢桿狀，陽(yáng)性染色初步斷定乳酸菌

用選擇性培養(yǎng)基分批富集培養(yǎng)2-3代稀釋分離法分離單菌落，培養(yǎng)基為含麥芽汁、CaCO3的瓊脂培養(yǎng)基

根據(jù)透明圈挑選菌落

性能測(cè)定（鏡檢桿狀，染色陽(yáng)性；乳酸紙層析鑒定）

Rf值定性（有機(jī)酸呈黃斑點(diǎn)）

乳酸生成量測(cè)定（滴定法）第75頁(yè)/共108頁(yè)放線菌的分離：

以產(chǎn)鏈霉素菌種的分離為例

（從退化菌種中篩選）

取工業(yè)發(fā)酵液（含孢子）樣品1環(huán)放入帶玻璃珠的裝有10ml無(wú)菌水的小三角瓶中，搖勻

采用稀釋法制平板，獲取單菌落

斜面保藏高產(chǎn)菌恢復(fù)根據(jù)高產(chǎn)菌的特點(diǎn)，選擇目的菌落放大培養(yǎng)，發(fā)酵液性能測(cè)試篩選模型：形態(tài)依據(jù)第76頁(yè)/共108頁(yè)真菌的分離篩選：以啤酒酵母的分離為例

取發(fā)酵液少許以10倍稀釋成10-1-10-7

稀釋分離法取0.1ml加入固體培養(yǎng)基鋪平皿（×2）

在麥芽汁固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)48-72h

形態(tài)篩選根據(jù)正常株特點(diǎn)進(jìn)行挑選，接種斜面?zhèn)溆?/p>

純化，采用平板分離法進(jìn)一步純化，至少反復(fù)三次

①生成子囊孢子速度測(cè)定 ②發(fā)酵力測(cè)定性能測(cè)定③熱死溫度測(cè)定 ④凝集力測(cè)定 ⑤雙乙酰含量測(cè)定第77頁(yè)/共108頁(yè)菌種選育改良的具體目標(biāo)提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量提高目標(biāo)產(chǎn)物的純度，減少副產(chǎn)物改良菌種性狀，改善發(fā)酵過(guò)程改變生物合成途徑，以獲得高產(chǎn)的新產(chǎn)品第78頁(yè)/共108頁(yè)

第二節(jié)發(fā)酵高產(chǎn)菌種選育常規(guī)育種(誘變育種)細(xì)胞工程育種基于代謝調(diào)節(jié)的育種技術(shù)基因工程育種蛋白質(zhì)工程育種代謝工程育種

第79頁(yè)/共108頁(yè)選擇育種方法時(shí)綜合考慮的因素(1)待改良性狀的本質(zhì)及與發(fā)酵工藝的關(guān)系(如批式或連續(xù)發(fā)酵試驗(yàn))；

(2)對(duì)這一特定菌種的遺傳和生物化學(xué)萬(wàn)面認(rèn)識(shí)的明了程度；

(3)經(jīng)濟(jì)費(fèi)用。如果對(duì)特定菌種的基本性狀及其工藝知曉甚少，則多半采用隨機(jī)誘變、篩選及選育等技術(shù)：如果對(duì)其遺傳及生物化學(xué)方面的性狀已有較深的認(rèn)識(shí)，則可選擇基因重組等手段進(jìn)行定向育種。第80頁(yè)/共108頁(yè)誘變育種以微生物的自然變異作為基礎(chǔ)的生產(chǎn)選種的機(jī)率并不很高，一個(gè)基因的自然突變頻率僅10-6-10-10左右。誘變育種：以誘發(fā)突變?yōu)榛A(chǔ)的育種，是迄今為止國(guó)內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量、性能的主要手段。第81頁(yè)/共108頁(yè)誘變物理、化學(xué)或生物誘變方法第82頁(yè)/共108頁(yè)

一、誘變劑和誘變處理

物理誘變劑：射線如紫外線、X—射線、γ—射線，快中子；物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外線。許多高產(chǎn)菌株的選育都用過(guò)紫外線，對(duì)于一般實(shí)驗(yàn)室、中小型工廠都適用，也很安全。其他的幾種射線都是電離性質(zhì)的，有一定的穿透力，一般都由專業(yè)人員在專門的設(shè)備中使用，否則有一定危險(xiǎn)性。第83頁(yè)/共108頁(yè)化學(xué)誘變劑：化學(xué)因子如堿基類似物、5—氟尿嘧啶、烷化劑等?；瘜W(xué)誘變劑中使用最多、最有效的是烷化劑。使用化學(xué)誘變劑的優(yōu)缺點(diǎn)：1、大多數(shù)情況下，就突變數(shù)量而言，要比電離輻射更有效。

第84頁(yè)/共108頁(yè)化學(xué)誘變劑：

化學(xué)因子如堿基類似物、5—氟尿嘧啶、烷化劑等。化學(xué)誘變劑中使用最多、最有效的是烷化劑。1、大多數(shù)情況下，就突變數(shù)量而言，要比電離輻射更有效。2、化學(xué)誘變劑是很經(jīng)濟(jì)的，因?yàn)橹恍枰倭康暮线m的誘變劑，設(shè)備是實(shí)驗(yàn)室的一般玻璃器皿，一個(gè)蒸氣罩。而用電離輻射±行工作時(shí)，設(shè)備費(fèi)用大，并要注意安全性。3、大部分誘變劑是致癌劑，所以在使用中必須非常謹(jǐn)慎，要避免化學(xué)誘變劑與皮膚接觸，，且切勿吸入其蒸氣，有人對(duì)某些誘變劑極其敏感，甚至未直接接觸就會(huì)過(guò)敏，這就更要當(dāng)心。第85頁(yè)/共108頁(yè)誘變劑的選擇1．堿基類似物和羥胺具有很高的特異性，但很少使用，回復(fù)突變率高，效果不大。2．亞硝酸和烷化劑應(yīng)用的范圍較廣，造成的遺傳損傷較多。其中亞硝基胍和甲基磺酸乙酯常被稱為“超誘變劑”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的誘變劑之一。3．吖啶類誘變劑可以造成生化代謝途徑的完全中斷。4．紫外線仍十分有效。電離輻射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑，它能造成不可回復(fù)的缺突變。但它可能影響鄰近基因的性能。第86頁(yè)/共108頁(yè)誘變育種的基本方法出發(fā)菌株的選擇處理菌懸液的制備誘變處理中間培養(yǎng)分離和篩選第87頁(yè)/共108頁(yè)(一)出發(fā)菌株的選擇1．自然界新分離的野生型菌株，對(duì)誘變處理較敏感，容易達(dá)到好的效果。2．在生產(chǎn)中經(jīng)生產(chǎn)選種得到的菌株與野生型較相像，也是良好的出發(fā)菌株。3．每次誘變處理都有一定提高的菌株，往往多次誘變能積累較多的提高。4．出發(fā)菌株開始時(shí)可以同時(shí)選2～3株，在處理比較后，將更適合的出發(fā)菌株留作繼續(xù)誘變。第88頁(yè)/共108頁(yè)5．要盡量選擇單倍體細(xì)胞、單核或核少的多細(xì)胞體來(lái)作出發(fā)誘變細(xì)胞，這是由于變異性狀大部分是隱性的，特別是高產(chǎn)基因。

6．根據(jù)采用的誘變劑或根據(jù)細(xì)胞生理狀態(tài)或誘變譜選擇誘變劑，因?yàn)橥徽T變劑的重復(fù)處理會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生抗性，使誘變效果下降。有的誘變劑是作用于營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，就要選對(duì)數(shù)期的細(xì)胞：有的作用于休止期，就可選用孢子。第89頁(yè)/共108頁(yè)

(二)處理菌懸液的制備這一步驟的關(guān)鍵是制備單細(xì)胞和單孢子狀態(tài)的、活力類似的菌懸液，為此要進(jìn)行合適培養(yǎng)基的培養(yǎng)，并要離心，洗滌，過(guò)濾。第90頁(yè)/共108頁(yè)(三)誘變處理結(jié)合誘變對(duì)象的實(shí)際，設(shè)計(jì)誘變處理方案。第91頁(yè)/共108頁(yè)

(四)中間培養(yǎng)

由于在發(fā)生了突變尚未表現(xiàn)出來(lái)之前，有一個(gè)表現(xiàn)延遲的過(guò)程，即細(xì)胞內(nèi)原有酶量的稀釋過(guò)程(生理延遲)，需3代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來(lái)。這個(gè)過(guò)程對(duì)今后的篩選和獲得穩(wěn)定菌株都是極為重要的。第92頁(yè)/共108頁(yè)

方法措施：讓變異處理后細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時(shí)，以讓細(xì)胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制，讓細(xì)胞繁殖幾代，以得到純的變異細(xì)胞。這樣，隱性的變異就會(huì)顯現(xiàn)出來(lái)，若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng)，直接在平皿上分離就會(huì)出現(xiàn)變異和不變異細(xì)胞同時(shí)存在于一個(gè)菌落內(nèi)的可能，形成混雜菌落，以致造成篩選結(jié)果的不穩(wěn)定和將來(lái)的菌株退化。第93頁(yè)/共108頁(yè)(五)分離和篩選篩選分初篩和復(fù)篩。初篩以迅速篩出大量的達(dá)到初步要求的分離菌落為目的，以量為主。復(fù)篩則是精選，以質(zhì)為主，也就是以精確度為主。因此在具體方法上就有差異.

例如初篩可以在平皿上直接以菌落的代謝產(chǎn)物與某些染料或基質(zhì)的作用形成的變色圈或透明圈的大小來(lái)挑取參加復(fù)篩者，而將90%的菌落淘汰。在數(shù)量減少后就要仔細(xì)比較參加復(fù)篩和再?gòu)?fù)篩的菌株，最后才能選得優(yōu)秀菌株。在以后的復(fù)篩階段，還應(yīng)不斷結(jié)合自然分離，純化菌株。第94頁(yè)/共108頁(yè)（1）營(yíng)養(yǎng)缺陷型的選育營(yíng)養(yǎng)缺陷型是指通過(guò)誘變而產(chǎn)生的缺乏合成某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸、維生素和堿基等的能力，必須在其基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)成分才能正常生長(zhǎng)的變異株。與營(yíng)養(yǎng)缺陷型對(duì)應(yīng)的是野生型。能滿足野生型菌株正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)基稱基本培養(yǎng)基(MM)；在基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)成分的稱補(bǔ)充培養(yǎng)基(SM)；能滿足各種營(yíng)養(yǎng)缺陷型生長(zhǎng)的稱完全培養(yǎng)基(CM)，如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基等。第95頁(yè)/共108頁(yè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的用途

營(yíng)養(yǎng)缺陷型在生產(chǎn)上和科學(xué)研究上用途很大。目前生產(chǎn)氨基酸、核苷酸的菌種都是各種類型的缺陷型。要研究代謝途徑，育種技術(shù)都必須有營(yíng)養(yǎng)缺陷型的菌株為材料。第96頁(yè)/共108頁(yè)篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型的步驟誘變淘汰野生型檢出缺陷型確定生長(zhǎng)譜具體方法：影印法、點(diǎn)種法、夾層法第97頁(yè)/共108頁(yè)賴氨酸生產(chǎn)菌種的選育改良思路出發(fā)菌株：黃色短桿菌、谷氨酸棒桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌育種思路

1.優(yōu)先合成的轉(zhuǎn)換——滲漏缺陷型的選育

2.切斷支路代謝——營(yíng)養(yǎng)缺陷型的選育：高絲氨酸缺陷型

3.抗結(jié)構(gòu)類似物突變株的選育：AEC4.解除代謝互鎖：Leu-、

抗Leu結(jié)構(gòu)類似物、喹啉s

、苯醌s5.增加前體物的合成和阻塞副產(chǎn)物的生成：

Ala-、抗Asp結(jié)構(gòu)類似物

選育適宜的CO2固定酶/TCA循環(huán)酶活性比突變株

6.改善細(xì)胞膜的透過(guò)機(jī)能

7.選育溫度敏感突變株

8.應(yīng)用細(xì)胞工程和基因工程育種

第98頁(yè)/共108頁(yè)第99頁(yè)/共108頁(yè)選育適宜的CO2固定酶/TCA循環(huán)酶活性比突變株賴氨酸合成中間代謝有以下兩條途徑：①通過(guò)TCA循環(huán)葡萄糖丙酮酸草酰乙酸天冬氨酸

賴氨酸②通過(guò)磷酸烯醇丙酮酸羧化反應(yīng)葡萄糖磷酸烯醇草酰乙酸天冬氨酸式丙酮酸