微生物的分離、純化與接種技術接種工具和方法在實驗室或工廠實踐中，用得最多的接種工具是接種環(huán)、接種針。由于接種要求或方法的不同，接種針的針尖部常做成不同的形狀，有刀形、耙形等之分。有時滴管、吸管也可作為接種工具進行液體接種。在固體培養(yǎng)基表面要將菌液均勻涂布時，需要用到涂布棒。

接種和分離工具1．接種針2.接種環(huán)3.接種鉤4.5.玻璃涂棒6.接種圈7.接種鋤8.小解剖刀

第一頁，共29頁。微生物的分離、純化與接種技術劃線接種：這是最常用的接種方法。即在固體培養(yǎng)基表面作來回直線形的移動，就可達到接種的作用。常用的接種工具有接種環(huán)，接種針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。第二頁，共29頁。劃線接種，分離純化Inoculatinganagarplatetoobtainsinglecolonies第三頁，共29頁。灼燒第四頁，共29頁。第五頁，共29頁。微生物的分離、純化與接種技術斜面接種技術第六頁，共29頁。微生物的分離、純化與接種技術

－－細菌的涂布分離技術第七頁，共29頁。微生物的分離、純化與接種技術

－－液體接種法、穿刺接種液體接種法：包括從斜面菌種接入培養(yǎng)液，或從液體菌種接入液體培養(yǎng)液，兩種情況都可以用接種環(huán)接種。但在培養(yǎng)量比較大的情況下，液體接種宜采用移液管接種，同時要求無菌操作。第八頁，共29頁。微生物的培養(yǎng)

－－微生物培養(yǎng)中的氧氣條件培養(yǎng)設備：包括接種室、恒溫培養(yǎng)室、恒溫培養(yǎng)箱、液體發(fā)酵——搖床、厭氧培養(yǎng)罐等。好氧培養(yǎng)：例如平板培養(yǎng)、斜面培養(yǎng)、淺層液體培養(yǎng)、液體振蕩培養(yǎng)或通氣攪拌培養(yǎng)等都屬于好氧培養(yǎng)的方法。厭氧培養(yǎng)：除了最簡便的深層液體培養(yǎng)以外，可以采用物理、化學或生物學的方法來排除培養(yǎng)容器中的空氣或空氣中的氧氣，創(chuàng)造厭氧條件。對于嚴格厭氧的微生物，要用化學和物理并用的方法。在進行厭氧培養(yǎng)時，可以用指示劑檢查系統(tǒng)中的還原條件，一般實驗室中常用的如葡萄糖——美蘭指示劑。第九頁，共29頁。微生物的培養(yǎng)

－－微生物培養(yǎng)中的厭氧條件生物學方法：利用植物呼吸作用，造成厭氧條件，常用的方法是在密封的干燥器底部放入發(fā)芽種子，因種子的呼吸作用增強，吸收氧氣，創(chuàng)造厭氧條件。此法簡易，但厭氧程度低?；瘜W方法：利用焦性沒食子酸吸收容器中的氧氣。在容器的一邊放一包用吸水紙包好的焦性沒食子酸，在另一邊放入堿液，容器密封后，讓堿液流向焦性沒食子酸一邊，兩者反應時吸收容器中的氧氣，創(chuàng)造厭氧條件。物理方法：常用真空泵抽出密封干燥器內的空氣或再充入其它惰性氣體，以保證厭氧條件。抽氣前，容器內放入指示劑和培養(yǎng)物。一般為達到嚴格厭氧目的，常采用物理和化學相結合并用的方法。第十頁，共29頁。微生物的培養(yǎng)

－－微生物培養(yǎng)中的厭氧培養(yǎng)美蘭氧化還原指示劑：0.006NNaOH0.015%美蘭溶液6％葡萄糖溶液上列三種溶液在使用時等量混合，加熱使美蘭退色，迅速放入?yún)捬豕拗小５谑豁?，?9頁。細菌生理學檢查法

－－微生物保藏方法斜面冰箱保藏法：將菌種接在新鮮斜面培養(yǎng)基上，定溫培養(yǎng)長出豐滿菌苔后，一般形成芽孢的細菌要形成芽孢，形成孢子的微生物要長出孢子，貼上標簽，放在試管架上，在棉塞部位用尼龍紙或防水紙包好，放入40C冰箱中保藏。一般每隔3個月至半年用新鮮培養(yǎng)基移植1次。方法簡便，實驗室均采用。

缺點：移接代數(shù)太多，易產(chǎn)生變異、退化。石蠟封藏法：在已長好的斜面菌種上加入無菌液體石蠟油，高出斜面1cm直立試管放入冰箱保藏，適用保存細菌和放線菌。石蠟的處理：250mL三角瓶裝100mL液體石蠟，1.05kg/cm3高壓滅菌30min，然后放在1050C左右的烘箱中1h，使水分蒸發(fā)掉。砂土管保藏法：(可用于保藏產(chǎn)孢子的放線菌、霉菌和產(chǎn)芽孢的細菌）。1.砂土管的制備：取河沙若干，用40目過篩，出去大顆粒，加10％HCl后煮沸30min，除去有機質（也可用10％HCl浸泡2—4h)。最后倒去酸水，用自來水沖洗至中性，烘干備用。另取0.3m以下非耕作層的瘦黃土若干，曬干磨細，過120目篩。2.按土：砂＝1：4的比例均勻混合，裝入指形管中，以1cm高為宜，塞上棉塞，160～1700C干熱滅菌2h。3.在新鮮菌種斜面上加入3mL左右的無菌水，用無菌接種環(huán)制成菌懸液，用無菌吸管吸取0.2～0.3mL的菌懸液放入每個砂土管中，用接種環(huán)拌勻，并貼上標簽，注明菌名。4.菌液加好后，立即進行抽真空干燥，要求在24h內抽干，尤其是夏天要求較短時間內抽干。搖散砂土，放干燥器內冰箱保藏。冷凍真空干燥保藏法：此法一般常用于細菌或病毒一類的菌種保藏，常用脫脂牛奶或血清作為菌種的保護劑。第十二頁，共29頁。細菌生理學檢查法

－－微生物生化反應生化反應來測定微生物的代謝產(chǎn)物，生化反應常用來鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物。糖酵解試驗淀粉水解試驗V-P試驗甲基紅（MethylRed）試驗靛基質（Imdole）試驗枸椽酸鹽試驗：尿素酶（Urease）試驗三糖鐵（TSI）瓊脂試驗第十三頁，共29頁。細菌生理學檢查法

－－糖酵解試驗

不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能利用者，或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣?？捎弥甘緞┘鞍l(fā)酵管檢驗。第十四頁，共29頁。細菌生理學檢查法

－－淀粉水解試驗某些細菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍色。第十五頁，共29頁。細菌生理學檢查法

－－乙酰甲基甲醇（V-P）試驗某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V－P（+）反應。第十六頁，共29頁。細菌生理學檢查法

－－甲基紅（MR）試驗

腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。第十七頁，共29頁。細菌生理學檢查法

－－靛基質（吲哚）試驗某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應表現(xiàn)出來。吲哚與對二甲基氨基苯醛結合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。第十八頁，共29頁。細菌生理學檢查法

－－檸檬酸鹽試驗某些細菌能利用檸檬酸鹽作為碳源，及磷酸銨作為氮源，將枸椽酸鹽分解為二氧化碳，培養(yǎng)基反應后成堿性，由于指示劑的作用，培養(yǎng)基變?yōu)樘m色。第十九頁，共29頁。細菌生理學檢查法

－－尿素酶（Urease）試驗有些細菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生2個分子的氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。1、未接種2、尿素酶陽性3、尿素酶陰性第二十頁，共29頁。細菌生理學檢查法

－－三糖鐵（TSI）瓊脂試驗

本試驗可同時觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細菌利用培養(yǎng)基中含氮物質，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。a.uninoculated

b.littlechange/alkaline/-/-

c.alkaline/acid/-/+

d.acid/acid/+/+

e.acid/acid/+/-

第二十一頁，共29頁。細菌生理學檢查法

－－沙門氏菌的TSI試驗第二十二頁，共29頁。食品衛(wèi)生細菌學一般檢驗技術

食品衛(wèi)生細菌學檢驗的目的，是要對食品進行細菌衛(wèi)生評價。這就要求檢驗人員在求實的精神下，科學地進行被檢對象的采樣、樣品送檢、檢樣處理、檢驗以及報告。在整個過程中，不得摻雜檢驗人員的絲毫主觀臆想和工作上的馬虎，要有章可依地進行檢驗和報告。樣品的采樣→送檢→樣品的處理→檢驗與報告

第二十三頁，共29頁。食品微生物檢樣的采集樣品種類樣品可分大樣、中樣、小樣三種。大樣是指一整批樣品；中樣是指從樣品各部分取得的混合樣品，定型包裝及散裝食品均采樣及散裝食品均采樣250g；小樣系指分析用的樣品，又稱為檢樣，檢樣一般為25g。采樣的方法根據(jù)樣品，如袋裝、瓶裝或罐裝食品，應采用完整的未開封的樣品；檢樣是冷凍食品，應保持冷凍狀態(tài)（可放在冰內、冰箱的冰盒內或低溫冰箱保存），非冷凍食品需在0～5℃中保存。（1）液體樣品的采樣：將樣品充分混勻，無菌操作開啟包裝，用100ml無菌注射器抽取，放入無菌容器。（2）半固體樣品的采樣：無菌操作開啟包裝，用滅菌勺子從幾個部位挖取樣品，放入無菌容器。（3）固體樣品的采樣：大塊整體食品應用無菌刀具和鑷子從不同部位取樣，應兼顧表面和深度，注意樣品代表性；小塊大包裝食品應從不同部位的小塊上切取樣品，放入無菌容器。樣品是固體粉末，應邊取樣邊混合。第二十四頁，共29頁。食品微生物檢樣的采集

（4）冷凍食品的采樣：大包裝小塊冷凍食品的采樣按小塊個體采??；大塊冷凍食品可以用無菌刀從不同部位削取樣品或用無菌小手鋸從冷凍上鋸取樣品，也可以用無菌鉆頭鉆取碎樣品，放入無菌容器。注：固體樣品或冷凍食品取樣還應注意檢樣目的，若需檢驗食品污染情況，可取表層樣品；若需檢驗其品質情況，應再取深部樣品。（5）生產(chǎn)工序監(jiān)測采樣車間用水：自來水樣從車間各水龍頭上采取冷卻水，湯料從車間容器不同部位用100ml無菌注射器抽取。車間臺面、用具及加工人員手的衛(wèi)生監(jiān)測：用板孔5cm2無菌采樣板及5支無菌擦拭25cm2面積。車間空氣采樣：將5個直徑90mm的普通營養(yǎng)瓊脂平板分別置于車間的四角和中部，打開平皿蓋5min，然后蓋上平板送檢。第二十五頁，共29頁。食品微生物檢樣的采集采樣的數(shù)量采樣的標簽：采樣前或后應立即貼上標簽，每件樣品必須標記清楚，如品名、來源、數(shù)量、采樣地點、采樣人及采樣時間（年、月、日）取樣注意事項：防止交叉污染或二次污染：取樣人員的個人衛(wèi)生控制；取樣地點的環(huán)境控制，空氣凈化要達到要求；取樣的器皿要求徹底消毒，避免直接與空氣接觸；取樣的操作要規(guī)范、迅速（無菌操作）；減少樣品存放的時間（保持樣本原有的狀態(tài)、易變質的樣本要冷藏）取樣要有代表性：取樣的數(shù)量標準；取樣的方法采樣所出的問題第二十六頁，共29頁。食品微生物檢驗的樣品送檢采樣后，在送檢過程中，要盡可能保持檢樣原有的物理和微生物狀態(tài)，不要因送檢過程而引起微生物的減少或增多。無菌方法采樣后，所裝樣品的容器要無菌，裝樣后盡可能密封，以防止環(huán)境中的微生物進一步污染；進行微生物檢驗的樣品，送達實驗室要越快越好，一般不應超過3h。若路途遙遠