去泛素化酶USP26調(diào)控KLF6蛋白穩(wěn)定性的機(jī)制研究去泛素化酶USP26調(diào)控KLF6蛋白穩(wěn)定性的機(jī)制研究

摘要：KLF6是一種轉(zhuǎn)錄因子，在多種疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。先前的研究發(fā)現(xiàn)，其穩(wěn)定性受到泛素化調(diào)控，但具體機(jī)制尚不清楚。本研究通過質(zhì)譜分析和免疫共沉淀等技術(shù)篩選出與KLF6交互的蛋白，發(fā)現(xiàn)去泛素化酶USP26可以誘導(dǎo)KLF6的去泛素化，并促進(jìn)其穩(wěn)定性。我們進(jìn)一步驗(yàn)證了該機(jī)制在人肝癌細(xì)胞系中的存在，并通過采用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除USP26基因來證實(shí)其對(duì)KLF6進(jìn)行去泛素化的重要性。此外，我們還發(fā)現(xiàn)USP26表達(dá)水平受到miR-628-5p的負(fù)調(diào)控。總體而言，本研究揭示了USP26調(diào)控KLF6蛋白穩(wěn)定性的新機(jī)制，為進(jìn)一步研究KLF6的生物學(xué)功能提供了新思路。

關(guān)鍵詞：KLF6；去泛素化；USP26；肝癌

1.引言

KLF6是一種Krüppel樣鋅指蛋白，最初被發(fā)現(xiàn)與乳腺癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，KLF6在多種疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用，包括肝癌、前列腺癌、肺癌等等[1]。先前的研究發(fā)現(xiàn)，KLF6的穩(wěn)定性受到泛素化調(diào)控[2]。然而，具體的機(jī)制還不清楚。

2.方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)與基因表達(dá)

我們采用了人肝癌細(xì)胞系HepG2和肝癌細(xì)胞系Huh7。所有細(xì)胞系均在37℃下、含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，含有Penicillin-Streptomycin的。我們使用Lipofectamine2000（Invitrogen）將質(zhì)粒DNA送入細(xì)胞中，以實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染。miRNA的轉(zhuǎn)染則使用LipofectamineRNAiMAX（Invitrogen）。

2.2免疫共沉淀

我們?cè)诩?xì)胞裂解液中加入適量的抗體，與蛋白進(jìn)行結(jié)合。蛋白抗體復(fù)合物被加入含有蛋白A/G-Sepharose（AmershamPharmaciaBiotech）的管柱中，并進(jìn)行混洗。在洗去非特異性結(jié)合后，我們使用SDS進(jìn)行分離和檢測(cè)。

2.3質(zhì)譜分析

我們使用TMT標(biāo)記（tandemmasstag）來標(biāo)記樣本，并使用多維色譜分離技術(shù)進(jìn)行樣品處理。

2.4CRISPR-Cas9敲除

我們使用CRISPR-Cas9技術(shù)，以目的性引導(dǎo)RNA（gRNA）為模板進(jìn)行構(gòu)建，以實(shí)現(xiàn)針對(duì)USP26基因的敲除。我們使用WesternBlot和PCR技術(shù)來證實(shí)敲除效果。

3.結(jié)果

通過免疫共沉淀和質(zhì)譜分析，我們篩選出了與KLF6交互的多種蛋白，包括去泛素化酶USP26。我們進(jìn)一步通過免疫共沉淀和WesternBlot技術(shù)，證實(shí)了KLF6和USP26之間的相互作用和USP26誘導(dǎo)KLF6去泛素化的能力。此外，我們還驗(yàn)證了該機(jī)制在人肝癌細(xì)胞系中的存在，并通過CRISPR-Cas9技術(shù)敲除USP26基因的方法，證實(shí)了其對(duì)于KLF6去泛素化的重要性。最終，我們還發(fā)現(xiàn)USP26的表達(dá)水平受到miR-628-5p的負(fù)調(diào)控。

4.討論與結(jié)論

本研究揭示了USP26調(diào)控KLF6蛋白穩(wěn)定性的新機(jī)制，為進(jìn)一步研究KLF6的生物學(xué)功能提供了新思路。未來，我們還將探究USP26對(duì)其他重要蛋白的調(diào)控機(jī)制，以及其在肝癌等多種疾病中的作用5.材料和方法

5.1細(xì)胞培養(yǎng)

我們使用人肝癌細(xì)胞系Huh7和HepG2作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停謩e在DMEM和MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-鏈霉素。細(xì)胞在37℃下，5%CO2的條件下培養(yǎng)。

5.2免疫共沉淀

我們使用ProteinA/G瓊脂糖為基礎(chǔ)，將抗體交聯(lián)在瓊脂糖上，用于免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。在細(xì)胞裂解液中加入預(yù)先固定在瓊脂糖上的抗體，使其與蛋白結(jié)合，然后將混合液旋轉(zhuǎn)沉淀并進(jìn)行清洗，最終離心取得免疫沉淀物。

5.3WesternBlot

為了驗(yàn)證KLF6和USP26之間的相互作用和USP26誘導(dǎo)KLF6去泛素化的能力，我們使用WesternBlot技術(shù)。將細(xì)胞進(jìn)行裂解，將裂解液進(jìn)行電泳分離，然后將其轉(zhuǎn)移到聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行固定，并用對(duì)應(yīng)的抗體進(jìn)行檢測(cè)。

5.4PCR

為了證實(shí)CRISPR-Cas9技術(shù)敲除USP26基因的效果，我們使用PCR技術(shù)。提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)USP26基因序列設(shè)計(jì)引物，并進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。

6.結(jié)論

本研究成功鑒定出去泛素化酶USP26是與KLF6相互作用的蛋白，并證實(shí)了其誘導(dǎo)KLF6去泛素化的能力。此外，我們還發(fā)現(xiàn)USP26的表達(dá)水平受到miR-628-5p的負(fù)調(diào)控。未來，我們將進(jìn)一步探究USP26在其他生物學(xué)過程中的作用，以及其在肝癌等多種疾病中的調(diào)節(jié)機(jī)制7.討論

本研究發(fā)現(xiàn)了USP26是與KLF6相互作用的蛋白，并證實(shí)了其誘導(dǎo)KLF6去泛素化的能力。USP26早在2007年就被發(fā)現(xiàn)具有去泛素化的作用，但其在肝癌中的作用一直沒有得到充分的研究。我們的研究證實(shí)了USP26在肝癌中的重要性，有望成為肝癌治療的新靶點(diǎn)。

在研究過程中，我們還發(fā)現(xiàn)USP26的表達(dá)水平受到miR-628-5p的負(fù)調(diào)控。miR-628-5p已經(jīng)被證實(shí)在多種癌癥中具有調(diào)節(jié)作用，包括胃癌、結(jié)直腸癌和乳腺癌等。我們的結(jié)果提示miR-628-5p也在肝癌中具有重要作用，并有望成為肝癌治療的新靶點(diǎn)。

盡管我們已經(jīng)確定了USP26與KLF6的相互作用，但具體的作用機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。同時(shí)，我們也需要進(jìn)一步明確USP26在其他生物學(xué)過程中的作用，以及其在其他疾病中的調(diào)節(jié)機(jī)制。這些研究將有助于深入理解USP26的生物學(xué)功能，為改善相關(guān)疾病的治療提供新思路。

8.結(jié)束語

本研究發(fā)現(xiàn)了去泛素化酶USP26是與KLF6相互作用的蛋白，并證實(shí)了其誘導(dǎo)KLF6去泛素化的能力。此外，我們還發(fā)現(xiàn)USP26的表達(dá)水平受到miR-628-5p的負(fù)調(diào)控。這些結(jié)果為深入理解肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供了新思路，為肝癌的治療提供了新的靶點(diǎn)。未來，我們將繼續(xù)開展深入研究，以完全闡明USP26在肝癌中的生物學(xué)功能此外，我們也將進(jìn)一步探究USP26在其他生物學(xué)過程中的作用，例如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控和DNA修復(fù)等。同時(shí)，我們也需要深入挖掘miR-628-5p在肝癌中的作用機(jī)制，并探究與其相關(guān)信號(hào)通路的交互作用。這些方面的研究有助于更加全面地認(rèn)識(shí)USP26與KLF6的相互作用及其在肝癌中的作用機(jī)制，為今后的肝癌治療提供更為深入的理論基礎(chǔ)。

此外，我們的研究還提示了去泛素化酶USP26的潛在價(jià)值，有望成為其他疾病治療的新靶點(diǎn)。例如，近年來USP26在乳腺癌、胃腸道腫瘤和肺癌等多種腫瘤中的表達(dá)水平異常升高，且與預(yù)后不良和惡性轉(zhuǎn)移相關(guān)。此外，USP26還被發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)退行性疾病和感染性疾病中具有調(diào)節(jié)作用。因此，我們有理由相信，未來的研究將探究USP26在這些疾病中的調(diào)節(jié)機(jī)制，從而為提高疾病治療效果提供新思路。

綜上所述，本研究揭示了去泛素化酶USP26與KLF6的相互作用及其在肝癌中的作用機(jī)制，拓展了我們對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展的認(rèn)識(shí)。我們相信，這些研究結(jié)果將為肝癌治療提供新思路，同時(shí)也將深化我們對(duì)其他疾病的認(rèn)識(shí)，為未來疾病治療提供新的希望本研究揭示了去泛素化酶USP26與KLF6在肝癌中的相互作用及其作用機(jī)制。進(jìn)一步探究USP26在其他生物學(xué)過程中的作用和miR-628-