南工大生物分離工程第1頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三本章主要知識(shí)點(diǎn)什么是色譜分離技術(shù)？色譜分離技術(shù)的分類什么是色譜柱的理論塔板數(shù)以及如何計(jì)算？吸附色譜及其分類和基本原理什么是分配色譜？離子交換色譜的分類及應(yīng)用第2頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三凝膠色譜的分離原理及分類離子交換及疏水作用層析的原理高效液相色譜的分離原理及應(yīng)用蛋白質(zhì)分離的常用色譜方法有哪些？第3頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三色譜技術(shù)（分配色譜）概念：色譜技術(shù)是一組相關(guān)分離方法的總稱，色譜柱的一般結(jié)構(gòu)含有固定相（多孔介質(zhì)）和流動(dòng)相(氣體或液體)，根據(jù)物質(zhì)在兩相間的分配行為不同（由于親和力差異），經(jīng)過多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸…），達(dá)到分離的目的。第4頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三色譜分離方法的分類色譜分離方法很多，種類有四、五十種但常用于生物大分子分離的色譜方法，按機(jī)理分，有以下幾種：吸附色譜利用物理吸附性能的差異，吸附力不同分配色譜利用兩液相間分配系數(shù)的不同離子交換色譜利用離子交換原理，化學(xué)親和力不同凝膠色譜利用分子大小或形狀差異（排阻作用力的不同）第5頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三色譜法簡(jiǎn)單分類第6頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三色譜系統(tǒng)的基本組成第7頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三色譜分離的基本概念分配系數(shù)可由Langmuir方程得出Kd分配系數(shù)q、c溶質(zhì)在固相和液相中的濃度第8頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三保留時(shí)間（tR）和保留體積（VR）反應(yīng)樣品在柱子中的保留或阻滯能力，是色譜過程的基本熱力學(xué)參數(shù)之一第9頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三阻滯因子Rf阻滯因子是在色譜系統(tǒng)中溶質(zhì)的移動(dòng)速度和標(biāo)準(zhǔn)物（與固定相沒有親和力的流動(dòng)相Kd=0）的遷移率之比體現(xiàn)某一種溶質(zhì)與固定相之間的親和力大小，As:固定相平均截面積，Am:流動(dòng)相平均截面積第10頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三洗脫體積Ve色譜柱中，使溶質(zhì)從柱中流出所需流動(dòng)相體積，為洗脫體積不同的溶質(zhì)，由于和固定相的親和力的不同，洗脫體積也有所差異,Vm:色譜柱中流動(dòng)相體積，Vs色譜柱中固相體積第11頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三色譜柱的理論塔板數(shù)、塔板高度反應(yīng)不同時(shí)刻溶質(zhì)在色譜柱中的分布以及分離度與柱高之間的關(guān)系理論塔板數(shù)的計(jì)算方法：N理論塔板數(shù)tR保留時(shí)間W1/2半峰寬Wb峰底寬度理論塔板高度：L柱長(zhǎng)第12頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三吸附色譜原理:利用溶質(zhì)與吸附劑之間的分子吸附力(范德華力，包括色散力、誘導(dǎo)力、定向力以及氫鍵)的差異而實(shí)現(xiàn)分離，

吸附→解吸→再吸附→再解吸→反復(fù)多次洗脫→被測(cè)組分分配系數(shù)不同→差速遷移→分離關(guān)鍵要素：吸附劑和展開劑的選擇吸附劑：氧化鋁、硅膠、聚酰胺等，均含有不飽和的氧原子或氮原子以及能夠形成氫鍵的基團(tuán)，如-OH和-NH2

分離機(jī)制：各組分與流動(dòng)相分子爭(zhēng)奪吸附劑表面活性中心利用吸附劑對(duì)不同組分的吸附能力差異而實(shí)現(xiàn)分離第13頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三Adsorptionchromatography第14頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三常用的吸附劑：氧化鋁：有堿性氧化鋁、中性氧化鋁和酸性氧化鋁。①堿性氧化鋁，混有碳酸鈉等成分而帶有堿性，適用分離一些堿性成分，如生物堿類，但是不宜用于醛、酮、酯、內(nèi)酯等類型的化合物分離，因?yàn)橛袝r(shí)堿性氧化鋁可與上述成分發(fā)生次級(jí)反應(yīng)，如異構(gòu)化、氧化、消除反應(yīng)等。②中性氧化鋁是由堿性氧化鋁除去堿性雜質(zhì)，沖洗至中性。仍屬于堿性吸附劑的范疇，不適用于酸性成分的分離。③酸性氧化鋁是氧化鋁用稀硝酸或稀鹽酸處理得到的產(chǎn)物，并使氧化鋁顆粒表面帶有NO3-或Cl-的陰離子，從而具有離子交換劑的性質(zhì)，酸性氧化鋁適合于酸性成分的柱色譜。硅膠：適用于中性或酸性成分的柱色譜。硅膠是一種弱酸性陽離子交換劑，其表面上的硅醇基能釋放弱酸性的氫離子，通過離子交換反應(yīng)吸附化合物。硅膠作為吸附劑有較大的吸附容量，能用于極性和非極性化合物的分離第15頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三活性炭：柱色譜用的活性炭，最好選用顆粒活性炭?；钚蕴渴欠菢O性吸附劑，其吸附作用與硅膠和氧化鋁相反，對(duì)非極性物質(zhì)具有較強(qiáng)的親和能力，在水溶液中吸附力最強(qiáng)，在有機(jī)溶劑中較弱，因此水的洗脫能力最弱而有機(jī)溶劑較強(qiáng)。主要分離水溶性成分，氨基酸、糖、苷等。

聚酰胺：為高分子聚合物質(zhì)，不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿及丙酮等常用有機(jī)溶劑，對(duì)堿較穩(wěn)定，對(duì)酸穩(wěn)定性較差，可溶于濃鹽酸、冰醋酸及甲酸。聚酰胺對(duì)有機(jī)物質(zhì)的吸附屬于氫鍵吸附，通過分子中的酰胺羰基與酚類、黃酮類化合物的酚羥基，或酰胺鍵上的游離氨基與醌類、脂肪羧酸上的羰基形成氫鍵締合而產(chǎn)生吸附。吸附的強(qiáng)弱則取決與各種化合物與之形成氫鍵締合的能力。主要用于分離黃酮類、蒽醌類、酚類、有機(jī)酸類、鞣質(zhì)類等成分。第16頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三展開劑的選擇展開劑極性越大，對(duì)同一化合物的洗脫能力越大因此，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整展開劑的極性以獲得最佳的分離的效果展開劑選擇的原則：（1）對(duì)被分離組分應(yīng)具有一定的解吸附能力，極性應(yīng)比被分離物質(zhì)的極性略?。?）展開劑應(yīng)對(duì)被分離物質(zhì)具有一定的溶解能力第17頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三常用展開劑的洗脫能力及極性比較見書上151~152第18頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三一般吸附色譜的操作程序根據(jù)要分離組分的性質(zhì)（包括極性、分子量、分子結(jié)構(gòu)）選擇合適的固定相和流動(dòng)相吸附操作：選擇合適的操作條件（溫度、pH值、流速），進(jìn)行裝柱、平衡、上樣，測(cè)定穿透樣品含量以調(diào)整操作參數(shù)洗脫：采用有機(jī)溶劑洗滌、調(diào)節(jié)pH值以及體系離子強(qiáng)度，最大限度地回收目標(biāo)產(chǎn)物第19頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三分配色譜原理：利用溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)不同而分離的方法要素：固定相、載體、流動(dòng)相

固定相→機(jī)械吸附在惰性載體上的液體流動(dòng)相→必須與固定相不為互溶

載體→惰性，性質(zhì)穩(wěn)定，不與固定相和流動(dòng)相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)分配色譜適合分離極性基團(tuán)相同而非極性部分差異教大,或溶解度相差較大,或極性太強(qiáng)不適合吸附色譜分離的化合物分離機(jī)制：利用組分在流動(dòng)相和固定相間溶解度差別進(jìn)行分離第20頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三第21頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三載體：通常為惰性材料，能吸附固定相液體載體種類：硅膠硅藻土纖維素葡聚糖凝膠第22頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三固定相：通常選取各組分溶解度大的溶劑作為固定相展開劑的選擇:選擇各組分溶解度相差大的溶劑展開劑事先用固定相飽和,防止破壞固定相流動(dòng)相可以是極性的（反相色譜法），也可以是非極性的（正相色譜）*反相色譜固定相是非極性的,流動(dòng)相是極性的第23頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三離子交換色譜以離子交換樹脂作為固定相，選擇合適的溶劑作為流動(dòng)相，分離機(jī)制：使溶質(zhì)按照其離子交換親合力的不同而得到分離的方法第24頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三常用的離子交換樹脂葡聚糖凝膠型

DEAE-SephadexA-25，QAE-SephadexA-25，CM-SephadexC-25，SP-SephadexC-25纖維素系列離子交換劑

DEAE-SephacelCellex系列瓊脂糖系列離子交換劑

Sepharose系列SepharoseCL-6B,SepharoseFastFlowBio-GelA系列交聯(lián)瓊脂糖離子交換劑第25頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三Source系列離子交換劑特點(diǎn)：介質(zhì)均勻、分辨率高、流速快、反壓低陽離子交換樹脂S系列陰離子交換樹脂Q系列MonoBeads系列離子交換劑（Pharmacia）特點(diǎn)：介質(zhì)為親水性聚醚，具有和Source系列相同的優(yōu)點(diǎn)，但動(dòng)態(tài)載量更大，壽命更長(zhǎng)。同樣分為Q系列和P系列第26頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三MiniQPC3.2/3:GlutathionesynthetaseSDSStartingmaterialPeak2第27頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三ExpandedBed第28頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三離子排斥色譜法待分離組分?jǐn)y帶電荷與離子交換樹脂骨架相同,而相互排斥,不同組分排斥力而獲得分離堿性抗生素帶正電荷,采用強(qiáng)堿性樹脂可進(jìn)行離子排斥色譜法分離,如卡那霉素A\B\C的分離.第29頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三(分子篩)凝膠色譜在樣品通過一定孔徑的凝膠固定相時(shí)，由于流經(jīng)體積的不同，使不同相對(duì)分子量的組分得以分離

固定相→多孔性凝膠流動(dòng)相→水——凝膠過濾色譜流動(dòng)相→有機(jī)溶劑——凝膠滲透色譜優(yōu)點(diǎn)： 操作簡(jiǎn)便 分離效果好，重復(fù)性高，回收率高 分離條件溫和 應(yīng)用廣泛適用于生物大分子的初級(jí)分離，脫鹽 分辨率低分離機(jī)制：利用分子大小不同、在固定相上選擇性滲透實(shí)現(xiàn)分離第30頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三第31頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三分子篩凝膠色譜原理第32頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三Desaltingproteinsproteinssalts第33頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三凝膠色譜填料葡聚糖凝膠SephadexG-系列聚丙烯酰胺凝膠

Sephacryl系列瓊脂糖凝膠Sepharose系列Superose系列第34頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三紙層析是一種常用的快速分離、鑒定方法，可用于定性分析以及確定分離方案，但一般不用于定量分析介質(zhì)：濾紙操作方法：將試樣溶于適當(dāng)溶劑中，點(diǎn)樣于濾紙的一端；選用適當(dāng)?shù)恼归_劑，借助毛細(xì)管現(xiàn)象從點(diǎn)樣的一端向另一端流動(dòng)，展開結(jié)束后，取下濾紙，晾干，染色顯跡第35頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三展開劑的選擇展開劑可以是單一溶劑，也可以是混合溶劑常用的氨基酸紙層析體系中使用的展開劑為：正丁醇-甲酸-水（15：3：2）展開方式：上行色譜，溶劑自下向上流動(dòng)下行色譜，溶劑自上向下流動(dòng)，該法適合性質(zhì)相近組分的分離徑向色譜顯跡：可采用化學(xué)試劑顯色，如氨基酸層析體系中常用茚三酮試劑顯色第36頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三薄層色譜法將固定相涂布在惰性固體上，形成薄層進(jìn)行色譜分離的方法常用的固定相有：硅膠和氧化鋁優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便快速顯色方式多，如可以選用濃硫酸等進(jìn)行顯色靈敏度高（較紙層析）可以大量制備第37頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三HPLC,高效液相色譜第38頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三HPLC分離原理液固吸附色譜:按照極性大小順序先后分離,非極性溶質(zhì)先流出液液分配色譜:類似于液-液萃取,同分配色譜離子交換色譜:與離子交換中心的不同親和力空間排斥色譜:類似于分子篩效應(yīng),小分子易滲透保留在凝膠內(nèi).30μm15μm5μm第39頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三反相液相色譜液-液色譜有正相和反相之分。如果采用極性固定相和相對(duì)非極性流動(dòng)相，就稱為正相；如果采用相對(duì)非極性固定相和極性流動(dòng)相，則稱為反相。由于極性化合物更容易被極性固定相所保留，所以正相液-液色譜系統(tǒng)一般可用于分離極性化合物。相反，反相液-液色譜系統(tǒng)一般可用于分離非極性或弱極性化合物。正相色譜的流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出；反相色譜的流出順序正好相反。另外，其他有些色譜如柱色譜也有正反相之分。反相液相色譜分離多肽和蛋白質(zhì)是基于蛋白質(zhì)的疏水性，因此通常采用非極性的烷基固定相作為填料，其表面化學(xué)性質(zhì)和流動(dòng)相的選擇應(yīng)最大限度地滿足疏水的要求。通常在流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑（三氟乙酸）來增大蛋白質(zhì)和多肽的疏水性第40頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三載體：微粒多孔硅膠（粒徑5μm~20μm）

HypersilSpherosilXOB075固定相：C18、C8烷基鏈，C8適于分離蛋白質(zhì)

C18適于分離核酸苯基流動(dòng)相的選擇通常采用有機(jī)溶劑，乙腈、異丙醇、正丙醇和四氫呋喃第41頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三為什么反相色譜應(yīng)用廣泛?它能使中性化合物和極性化合物在一根色譜柱中得到分離。適用于多種基體中的多類不同性質(zhì)化合物的測(cè)定和分離。保留時(shí)間可以用分子的疏水性進(jìn)行描述和解釋。所用高純度的水、甲醇和乙腈等溶劑價(jià)格便宜、實(shí)用。選擇性可通過用緩沖溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)（通過調(diào)節(jié)pH值來調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度和膠團(tuán)粒子大小等等），以實(shí)現(xiàn)最佳分離。第42頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三蛋白質(zhì)分離常用的色譜方法免疫親和層析 屬于吸附色譜中的一種，利用抗原-抗體作用的高度專一性以及較強(qiáng)的吸附力，實(shí)現(xiàn)特殊蛋白質(zhì)的分離免疫親和層析介質(zhì)的獲得：（1）獲得抗體（2）抗體連接到載體上第43頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三親和色譜（Affinitychromatography）載體活化、配基連接、吸附、洗脫第44頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三Competitiveelution第45頁，共50頁，2023年，2月20日，星期三疏水層析（HIC）

在載體表面連接上疏水的直鏈碳鏈或其他疏水基團(tuán)，如苯基，可以與蛋白質(zhì)的某些疏水基團(tuán)相互作用，從而實(shí)現(xiàn)多組分的分離。操作要點(diǎn):

蛋白質(zhì)的局部變性，鹽濃度高疏水作用強(qiáng)，但高鹽濃度下的選擇性