引物設(shè)計(jì)初學(xué)者第1頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四主要內(nèi)容背景PCR引物設(shè)計(jì)原則常用PCR引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier5.0介紹Oligo6.22介紹在線Primer3介紹第2頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四PCR聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)是80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)；能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬(wàn)乃至百萬(wàn)倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測(cè)鑒定。第3頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四PCR引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)是PCR技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)。使用不合適的PCR引物容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失?。罕憩F(xiàn)為擴(kuò)增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），不出帶或出帶很弱，等等。現(xiàn)在PCR引物設(shè)計(jì)大都通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行?？梢灾苯犹峤荒０逍蛄械教囟ňW(wǎng)頁(yè)，得到設(shè)計(jì)好的引物，也可以在本地計(jì)算機(jī)上運(yùn)行引物設(shè)計(jì)專業(yè)軟件。第4頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四引物設(shè)計(jì)的原則引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。第5頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四如引物長(zhǎng)度（primerlength），產(chǎn)物長(zhǎng)度（productlength），序列Tm值(meltingtemperature)，引物與模板形成雙鏈的內(nèi)部穩(wěn)定性(internalstability,用?G值反映)，形成引物二聚體(primerdimer)及發(fā)夾結(jié)構(gòu)（duplexformationandhairpin）的能值，在錯(cuò)配位點(diǎn)（falseprimingsite）的引發(fā)效率，引物及產(chǎn)物的GC含量（composition），等等。必要時(shí)還需對(duì)引物進(jìn)行修飾，如增加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，引進(jìn)突變等。具體因素第6頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四一般原則引物的長(zhǎng)度一般為15-30bp，常用的是18-24bp，但不應(yīng)大于38。引物過(guò)短又同時(shí)會(huì)引起錯(cuò)配現(xiàn)象，一般來(lái)說(shuō)引物長(zhǎng)度大于16bp是必要的（不容易引起錯(cuò)配）。例如：一個(gè)長(zhǎng)度為12bp的引物在人類基因組上存在200個(gè)潛在的退火位點(diǎn)(3x109/412=200).而一個(gè)長(zhǎng)度為20bp的引物在人基因組上存在的退火位點(diǎn)只有1/400個(gè).較長(zhǎng)的引物（28-35bp)一般是用來(lái)區(qū)分同源性較高的模板序列或者使用于產(chǎn)生一些突變位點(diǎn)第7頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四Tm值的計(jì)算一般的公式Tm=4(G+C)+2(A+T)

對(duì)于長(zhǎng)一些的引物可用更為準(zhǔn)確的nearest-neighbor（Frieretal.(1986)）第8頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四一般原則2.引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒(méi)有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物3’端出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加。

第9頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四一般原則3，引物3’端的末位堿基對(duì)Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3’端使用堿基A。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。5’端序列對(duì)PCR影響不太大，因此常用來(lái)引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。第10頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四一般原則4.引物序列的GC含量一般為40-60%，過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。不同的算法推薦45-55%或50-60%第11頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四一般原則5.?G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3’端?G值較低（絕對(duì)值不超過(guò)9），而5’端和中間?G值相對(duì)較高的引物。引物的3’端的?G值過(guò)高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。（能值越高越容易結(jié)合）第12頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四一般原則6.對(duì)引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。

第13頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四一般原則7.引物二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)PCR反應(yīng)的影響。盡可能少的引物二聚體。

第14頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四常用的引物設(shè)計(jì)軟件Oligo6（引物評(píng)價(jià)）*PrimerPremier（自動(dòng)搜索）*VectorNTISuitDnasisOmigaDnastarPrimer3（在線服務(wù)）*第15頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四PrimerPremier5.0的使用技巧簡(jiǎn)介主要功能:1、即引物設(shè)計(jì)2、限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分析3、DNA基元(motif)查找4、同源性分析第16頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)根據(jù)氨基酸序列來(lái)設(shè)計(jì)引物DNA引物PremierPrimer5提供了8種生物遺傳密碼使用的偏好選擇1、纖毛蟲(chóng)大核（CiliateMacronuclear）2、無(wú)脊椎動(dòng)物線粒體（InvertebrateMitochondrion）3、支原體（Mycoplasma）4、植物線粒體（PlantMitochondrion）5、原生動(dòng)物線粒體（ProtozoanMitochondrion）6、一般標(biāo)準(zhǔn)（Standard）7、脊椎動(dòng)物線粒體（VertebrateMitochondrion）8、酵母線粒體（YeastMitochondrion）第17頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四PrimerPremier5.0使用介紹(1)PreimerPremier啟動(dòng)界面Loadsequence第18頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四基本信息SequencenameOriginalsequenceUsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8種密碼子偏好Chooseafunction第19頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四引物設(shè)計(jì)界面FirstyoucandesigntheprimermanuallySensestrandoranti-sensestrandUsefulinformationoftheprimer第20頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四引物搜索選項(xiàng)設(shè)定引物類型搜索模式5’引物位置范圍3’引物位置范圍產(chǎn)物大小范圍引物長(zhǎng)度第21頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四搜索結(jié)果28對(duì)引物引物分值100分為滿分每對(duì)引物的信息雙擊選中一對(duì)引物第22頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四引物信息回到主窗口引物及產(chǎn)物信息是否出現(xiàn)hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer第23頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四一對(duì)理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)構(gòu)，因此最好的情況是最下面的分析欄沒(méi)有But…第24頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四引物編輯第25頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四引物編輯EditprimerhereAnalysistheeditresultAccepttheeditresultReturntothemainwindow第26頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四SomeotherusefulfunctionofPP5第27頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四Enzyme第28頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四MeltingtemperaturegraphPer25-mer第29頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四GC%graphPer25-mer第30頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四StabilityPer5-mer第31頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四Oligo6.44使用說(shuō)明主要功能：專門(mén)的引物設(shè)計(jì)軟件第32頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四Oligo6.44啟動(dòng)界面Opensequencefile第33頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3個(gè)彈出窗口Meltingtemperature第34頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四?GInternalStability第35頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四Frq為鄰近6至7個(gè)堿基組成的亞單位在一個(gè)指定數(shù)據(jù)庫(kù)文件中的出現(xiàn)頻率。該頻率高則可增加錯(cuò)誤引發(fā)的可能性。第36頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四用Oligo設(shè)計(jì)引物時(shí)的3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)Tm值曲線以選取5’到3’的下降形狀有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)。Frq曲線宜選用3’端Frq值相對(duì)較低的片段。ΔG值在5’端和中間值比較高，而在3’端相對(duì)低第37頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第38頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四選中引物上游引物下游引物只是示意圖第39頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四引物分析首先檢查引物二聚體尤其是3’端二聚體形成的可能性。第40頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四引物分析二項(xiàng)檢查是發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin）；與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好。第41頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期四引物分析第三項(xiàng)檢查為GC含量，以45-55％為宜。第四Falsepriming檢查第42頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月