病毒感染的分子診斷演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有52頁\編輯于星期四優(yōu)選病毒感染的分子診斷現(xiàn)在是2頁\一共有52頁\編輯于星期四病毒感染的分子診斷利用分子生物學方法對病毒進行檢測分子生物學方法包括核酸擴增、核酸雜交、等溫反應、質譜、普通測序、二代測序等檢測對象主要是病毒核酸現(xiàn)在是3頁\一共有52頁\編輯于星期四病毒感染的核酸檢測普通PCR、real-timePCR、巢式PCR、多重PCRFISH一代測序高通量測序現(xiàn)在是4頁\一共有52頁\編輯于星期四PCRKaryB.MullisUSA美國教授KaryB.Mullis于1983年發(fā)明了PCR技術，他因此獲得了1993年諾貝爾獎

現(xiàn)在是5頁\一共有52頁\編輯于星期四PCR現(xiàn)在是6頁\一共有52頁\編輯于星期四PCR優(yōu)缺點及應用優(yōu)點靈敏度高，特異性強操作簡單設備要求低缺點PCR產物分析較繁瑣，容易出現(xiàn)人為判讀錯誤只能進行定性檢測，無法實現(xiàn)定量分析應用病毒鑒定聯(lián)合測序用于病毒分型和病毒耐藥突變位點分析現(xiàn)在是7頁\一共有52頁\編輯于星期四Real-timePCR現(xiàn)在是8頁\一共有52頁\編輯于星期四4/8/2023Real-timePCR現(xiàn)在是9頁\一共有52頁\編輯于星期四Real-timePCR的優(yōu)缺點及應用優(yōu)點靈敏度極高，特異性極強機器分析判讀結果，減少人工判讀失誤可實現(xiàn)高通量檢測缺點易出現(xiàn)污染，對人員操作要求高要求房間分區(qū)，對場地硬件條件要求較高不同種屬病毒之間沒有相似核酸序列，多種病毒同時檢測較難實現(xiàn)應用幾乎應用于所有病毒感染的檢測，且在不同國家地區(qū)應用最為廣泛現(xiàn)在是10頁\一共有52頁\編輯于星期四諾如病毒熒光探針法檢測試劑盒全國首家獲批諾如病毒核酸檢測試劑盒現(xiàn)在是11頁\一共有52頁\編輯于星期四諾如病毒核酸檢測試劑盒（國械注準20153400293）（核酸類國內空白）人鼻病毒核酸檢測試劑盒（國械注準20153400295）（國內空白）人博卡病毒核酸檢測試劑盒（國械注準20153400294）（國際空白）現(xiàn)在是12頁\一共有52頁\編輯于星期四眼部病毒感染多重real-timePCR檢測試劑盒一個反應管中可同時檢測腸道病毒、腺病毒、單純皰疹病毒探針分別用FAM,HEX，CY3和CY5四種熒光標記的探針有內參，構建好了標準品，可進行絕對定量加入了UNG酶，可有效控制污染檢出限可達1-10copies\ml成本僅為市售試劑盒的1/10效益成本比：TAKARA>Roche>Bio-Rad>Thermo現(xiàn)在是13頁\一共有52頁\編輯于星期四Fluorescence

InSitu

Hybridization(FISH)CarloForestaetal.,PLOSONE,2011ClareConnor,Nature,2008HPV感染現(xiàn)在是14頁\一共有52頁\編輯于星期四FISH的優(yōu)缺點及應用優(yōu)點直接檢測病變組織細胞標本，對疾病的診斷意義更大可檢測病毒是否整合到人基因組缺點操作繁瑣，對人員素質要求高需要單獨的細胞培養(yǎng)間應用HPV,EBV,登革熱病毒，HIV現(xiàn)在是15頁\一共有52頁\編輯于星期四基于轉錄的擴增３種酶：逆轉錄酶、ＲＮＡ酶Ｈ和Ｔ７ＲＮＡ聚合酶２條特別設計的寡核苷酸引物恒溫反應，不需要PCR儀能將病原體RNA擴增109倍，比常規(guī)PCR高２～３個數(shù)量級現(xiàn)在是16頁\一共有52頁\編輯于星期四基于轉錄的擴增的優(yōu)缺點及應用優(yōu)點擴增時間短，恒溫反應條件，不需要PCR儀在等溫條件下，快速降解的RNA可極大減少擴增過程中污染的可能性缺點缺點是不能用于DNA病毒的檢測以及多種酶混合體系的不穩(wěn)定性應用在臨床上應用于HCV、HIV、腸道病毒和呼吸道RNA病毒的檢測現(xiàn)在是17頁\一共有52頁\編輯于星期四loop-mediatedisothermalamplification（LAMP）現(xiàn)在是18頁\一共有52頁\編輯于星期四LAMP的優(yōu)缺點及應用優(yōu)點等溫擴增，不需PCR儀，可實現(xiàn)床旁或野外環(huán)境靈敏度和特異性均較高缺點引物設計極為復雜，研發(fā)門檻高，獲批檢測試劑盒少應用目前僅結核分枝桿菌獲得CFDA認證，病毒檢測尚處于研發(fā)階段現(xiàn)在是19頁\一共有52頁\編輯于星期四數(shù)字PCR現(xiàn)在是20頁\一共有52頁\編輯于星期四數(shù)字PCR的優(yōu)缺點及應用優(yōu)點無需標準品，可直接進行絕對定量對標本中的抑制劑有較高耐受性為跨實驗室比較提供絕對參照標準缺點樣品分散技術的穩(wěn)定性有待提高，且成本較高通量較低，目前通常能檢測的信號為FAM和VIC應用目前僅用于科研，但在臨床病毒檢測和定量方面極具應用前景現(xiàn)在是21頁\一共有52頁\編輯于星期四Sanger測序現(xiàn)在是22頁\一共有52頁\編輯于星期四Sanger測序的優(yōu)缺點及應用優(yōu)點能對病毒進行分型、突變分析為病毒的傳播路徑等流行病學提供信息缺點通量低，一個反應體系只能分析一種病毒應用HBV、HCV、HIV、HSV、CMV、VZV、EBV、流感病毒等的抗病毒藥物適用性分析現(xiàn)在是23頁\一共有52頁\編輯于星期四深度測序現(xiàn)在是24頁\一共有52頁\編輯于星期四深度測序的優(yōu)缺點及應用優(yōu)點不需要對標本中的病毒有預期判斷，可以發(fā)現(xiàn)新發(fā)病毒感染通量高，可檢測到標本中含量少的病毒對于無菌體液中發(fā)現(xiàn)的病毒診斷價值高缺點海量數(shù)據(jù)，分析有難度部分標本中發(fā)現(xiàn)的病毒不一定與疾病相關應用重癥感染及新發(fā)突發(fā)傳染病疫情，比如埃博拉病毒，寨卡病毒，H7N9均是通過深度測序被診斷發(fā)現(xiàn)現(xiàn)在是25頁\一共有52頁\編輯于星期四法國梅里埃公司FilmArray?病原體全自動多重real-timePCR檢測系統(tǒng)現(xiàn)在是26頁\一共有52頁\編輯于星期四終點熔解曲線分析法國梅里埃公司FilmArray?病原體全自動多重real-timePCR技術原理現(xiàn)在是27頁\一共有52頁\編輯于星期四FilmArray?呼吸道病原體檢測組套美國FDA認證一個反應板能能同時檢測呼吸道相關的17種病毒和3種細菌僅需2分鐘將樣本加入反應管中，剩下的病原體核酸提取、PCR和結果判斷均為全自動操作1小時出結果但費用高昂病毒：腺病毒冠狀病毒229E冠狀病毒HKU1冠狀病毒OC43冠狀病毒NL63人偏肺病毒人鼻病毒/腸道病毒甲型流感病毒甲型流感病毒H1亞型甲型流感病毒H1-2009亞型甲型流感病毒H3亞型乙型流感病毒副流感病毒1型副流感病毒2型副流感病毒3型副流感病毒4型呼吸道合胞病毒細菌：百日咳桿菌肺炎支原體肺炎衣原體現(xiàn)在是28頁\一共有52頁\編輯于星期四FilmArray?腹瀉病原體檢測組套美國FDA認證一個反應板能能同時檢測腹瀉相關的5種病毒，6種細菌，6種致瀉性大腸桿菌和4種寄生蟲僅需2分鐘將樣本加入反應管中，剩下的病原體核酸提取、PCR和結果判斷均為全自動操作1小時出結果但費用高昂細菌：彎曲桿菌艱難梭菌類志賀鄰單胞菌沙門氏菌小腸結腸炎耶爾森氏菌弧菌病毒：腺病毒F40/F41亞型星狀病毒諾如病毒GI/GII亞型輪狀病毒札如病毒致瀉性大腸桿菌：EAECEPECETECSTECO157EIEC寄生蟲：隱孢子蟲環(huán)孢子蟲溶組織內阿米巴蘭氏賈第鞭毛蟲現(xiàn)在是29頁\一共有52頁\編輯于星期四FilmArray?腦炎腦膜炎病原體檢測組套美國FDA認證一個反應板能能同時檢測腹瀉相關的7種病毒，6種細菌，1種真菌僅需2分鐘將樣本加入反應管中，剩下的病原體核酸提取、PCR和結果判斷均為全自動操作1小時出結果但費用高昂真菌：隱球菌/新型隱球菌病毒：巨細胞病毒腸道病毒單純皰疹病毒1型單純皰疹病毒2型人皰疹病毒6型人細小病毒水痘帶狀皰疹病毒細菌：大腸桿菌K1流感嗜血桿菌產單核細胞李斯特菌腦膜炎奈瑟氏菌無乳鏈球菌肺炎鏈球菌現(xiàn)在是30頁\一共有52頁\編輯于星期四美國Luminex公司xTAG?

多重PCR微球探針檢測系統(tǒng)20mins1hr2.5hrs45mins現(xiàn)在是31頁\一共有52頁\編輯于星期四美國Luminex公司xTAG?

多重PCR微球探針檢測技術原理病毒核酸提取現(xiàn)在是32頁\一共有52頁\編輯于星期四美國Luminex公司xTAG?

多重PCR微球探針檢測技術原理MultiplexRT-PCRusingtarget-specificTAGgedprimers&biotinylatedprimersGGCTACCGATTAG13’5’BBdsbiotinylated,TAGgedTS-PCRproductCCGATGGCTA3’TAG15’GGCTATAG1CCGAT3’TAG25’B5’TARGETPRESENTTARGETABSENT病毒核酸擴增現(xiàn)在是33頁\一共有52頁\編輯于星期四TAGgedproductsarecapturedbytheircomplementaryAnti-TAGsequenceStreptavidin-phycoerythrinreporter(SA-PE)moleculeusedtodetectbiotinylatedprimerUniversalarraymadeupofdifferentbeadpopulationswithSA-PEreporterpresentAnti-TAG2TAG2Anti-TAG1BPERegion29SATAG1Region34美國Luminex公司xTAG?

多重PCR微球探針檢測技術原理擴增的病毒核酸與固定有特異性探針的納米微球雜交并檢測現(xiàn)在是34頁\一共有52頁\編輯于星期四美國Luminex公司xTAG?

多重PCR微球探針檢測技術原理Luminex100/200xMAPTechnologybasedonflowcytometryRedLaser&APDs:classifyanti-TAGcoupledbeadsGreenLaser&PMT:quantifiesreporter,representingspecifichybridizationeventsMAGPIXxMAPTechnologyusingLEDsandCCDRedLED&CCDcamera:classifyanti-TAGcoupledbeadsGreenLED&CCDcamera:quantifiesreporter,representingspecifichybridizationeventsReadonLuminex

200?orMAGPIX信號數(shù)據(jù)獲取并分析現(xiàn)在是35頁\一共有52頁\編輯于星期四美國FDA認證一個反應板能能同時檢測呼吸道相關的19種病毒，3種細菌需要進行病原體核酸提取、PCR、雜交和結果判斷需要手工加樣、擴增產物的人工轉移5小時出結果費用相對Flimarray較為經濟細菌：肺炎衣原體肺炎衣原體軍團菌病毒：腺病毒冠狀病毒229E冠狀病毒HKU1冠狀病毒OC43冠狀病毒NL63人博卡病毒人偏肺病毒人鼻病毒/腸道病毒甲型流感病毒甲型流感病毒H1亞型甲型流感病毒H1-2009亞型甲型流感病毒H3亞型乙型流感病毒副流感病毒1型副流感病毒2型副流感病毒3型副流感病毒4型呼吸道合胞病毒A型呼吸道合胞病毒B型xTAG?呼吸道病原體檢測組套現(xiàn)在是36頁\一共有52頁\編輯于星期四美國FDA認證一個反應板能能同時檢測腹瀉相關的3種病毒，6種細菌，3種致瀉性大腸桿菌和3種寄生蟲需要進行病原體核酸提取、PCR、雜交和結果判斷需要手工加樣、擴增產物的人工轉移5小時出結果費用相對Flimarray較為經濟細菌：彎曲桿菌艱難梭菌志賀菌沙門氏菌小腸結腸炎耶爾森氏菌霍亂弧菌病毒：腺病毒F40/F41亞型諾如病毒GI/GII亞型輪狀病毒A型致瀉性大腸桿菌：ETECO157EIEC寄生蟲：隱孢子蟲溶組織內阿米巴蘭氏賈第鞭毛蟲xTAG?腹瀉病原體檢測組套現(xiàn)在是37頁\一共有52頁\編輯于星期四美國賽沛公司的Xpert?病原體全自動real-time檢測系統(tǒng)1混合2加入3插入4檢測現(xiàn)在是38頁\一共有52頁\編輯于星期四美國賽沛公司的Xpert?病原體全自動real-time檢測技術原理高度集成化、自動化在一個反應杯里實現(xiàn)了標本病原體核酸的提取、PCR、檢測和數(shù)據(jù)分析現(xiàn)在是39頁\一共有52頁\編輯于星期四Xpert?病原體檢測項目美國FDA認證一個反應管僅能檢測1-2種病原體僅需2分鐘將樣本加入反應管中，剩下的病原體核酸提取、PCR和結果判斷均為全自動操作1-2小時出結果可檢測的病毒：甲型流感病毒\乙型流感病毒呼吸道合胞病毒腸道病毒HIV-1病毒載量定量HCV病毒載量定量諾如病毒人乳頭瘤病毒埃博拉病毒可檢測的細菌：艱難梭菌MRSACRE現(xiàn)在是40頁\一共有52頁\編輯于星期四美國GeneMark公司eSensor?探針-傳感器分子檢測系統(tǒng)多重RT-PCR之后用探針雜交再用伏安法電子傳感器檢測探針并分析信號現(xiàn)在是41頁\一共有52頁\編輯于星期四eSensor?呼吸道病毒檢測組套美國FDA認證能同時檢測8種呼吸道病毒腺病毒：B,C和E組冠狀病毒：229E,HKU1,OC43和NL63型甲型流感病毒：檢測并分型乙型流感病毒人偏肺病毒副流感病毒：1,2,3和4型呼吸道合胞病毒：A和B組

人鼻病毒需要進行病原體核酸提取、PCR、雜交和結果判斷需要手工或機器提取核酸、擴增產物的人工轉移4-5小時出結果現(xiàn)在是42頁\一共有52頁\編輯于星期四美國雅培公司Plex-id?

PCR-質譜串聯(lián)分子檢測系統(tǒng)多重RT-PCR利用電噴霧電離質譜分析產物現(xiàn)在是43頁\一共有52頁\編輯于星期四美國FDA認證同時檢測influenzaA和B

virus需要進行病原體核酸提取、多重PCR、質譜分析6-8小時出結果Plex-id?流感病毒檢測試劑盒現(xiàn)在是44頁\一共有52頁\編輯于星期四傳染病長效防控能力的提升和網絡實驗室持續(xù)競爭力的增強十一五十二五十三五在“十一五”、“十二五”基礎上，進一步完善監(jiān)測技術體系，大幅推動監(jiān)測技術普及下沉，全面提升病原發(fā)現(xiàn)鑒定能力和新發(fā)傳染病的識別能力。最終提高對傳染病暴發(fā)疫情監(jiān)測預警的敏感度和有效應對國內外重大傳染病疫情的處置能力。較為完善的監(jiān)測技術體系和質控管理體系較為豐富的重大疫情監(jiān)測實戰(zhàn)經驗較為高效的檢測技術平臺運轉和團隊協(xié)作機制國家科技重大專項牽頭建設單位現(xiàn)在是45頁\一共有52頁\編輯于星期四常規(guī)監(jiān)測從30種擴大為98種全覆蓋覆蓋樣本數(shù)15000份癥候群檢測病原體病毒細菌寄生蟲發(fā)熱呼吸道（23種）11種12種

流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、副流感病毒、偏肺病毒、冠狀病毒、博卡病毒、鼻病毒、MERS、H7N9、H5N1金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、A組乙型鏈球菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、軍團菌、結核分枝桿菌、卡他莫拉漢菌、鮑曼不動桿菌、肺炎支原體、肺炎衣原體腹瀉（22種）5種13種3種輪狀病毒、腸道腺病毒、諾如病毒、札如病毒、星狀病毒致瀉性大腸埃希菌（內含5個種）、非傷寒沙門菌、志賀菌、空腸彎曲菌、結腸彎曲菌、小腸結腸炎耶爾森菌、假結核耶爾森菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌、嗜水氣鄰單胞菌、類志賀鄰單胞菌、擬態(tài)弧菌、河弧菌阿米巴、藍氏賈第鞭毛蟲、隱孢子蟲病發(fā)熱伴出疹（15種）9種6種

腸道病毒（EV71，CA16，CA10，CA6）、麻疹病毒、風疹病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、登革病毒、人類小DNA病毒B19、EB病毒、人類皰疹病毒6型、埃博拉病毒傷寒沙門菌、副傷寒沙門菌、A組鏈球菌、炭疽、伯氏疏螺旋體、立克次體（內含多個種）發(fā)熱伴出血（11種）5種6種

漢坦病毒、登革病毒、新疆出血熱病毒、新布尼亞病毒、埃博拉病毒鼠疫耶爾森菌、豬鏈球菌、鉤端螺旋體、立克次體（內含多個種）、無形體（內含多個種）、埃立克體（內含多個種）腦炎腦膜炎（27種）10種8種9種寨卡、乙腦、腮腺炎、腸道病毒、單純皰疹、脊髓灰質炎、麻疹、呼吸道合胞病毒、西尼羅病毒、蜱傳腦炎病毒腦膜炎奈瑟菌、b型流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、豬鏈球菌、大腸桿菌、B族鏈球菌、單增李斯特菌惡性瘧原蟲、弓形蟲、帶絳蟲、新型隱球菌、肺吸蟲、并殖吸蟲、旋毛蟲、廣州管圓線蟲、裂頭蚴現(xiàn)在是46頁\一共有52頁\編輯于星期四擴大病原體監(jiān)測范圍五大癥候群擴大監(jiān)測范圍病原體病原體名稱導致疾病EVD68發(fā)熱呼吸系統(tǒng)疾病雙埃可病毒發(fā)熱呼吸系統(tǒng)疾病、腹瀉、腦炎腦膜炎淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒病腦炎腦膜炎H10N8發(fā)熱呼吸系統(tǒng)疾病基孔肯亞病毒發(fā)熱伴出疹疾病尼帕病毒發(fā)熱呼吸系統(tǒng)疾病、腦炎腦膜炎墨累谷腦炎病毒腦炎腦膜炎現(xiàn)在是47頁\一共有52頁\編輯于星期四