第四節(jié)生物樣品測定方法的驗證指標(biāo)和分析方法的考核任何一種分析測定方法，根據(jù)其使用的對象和要求，都應(yīng)有相應(yīng)的效能指標(biāo)。一般而言，常用的分析效能評價指標(biāo)包括：精密度、準(zhǔn)確度、檢測限、定量限、選擇性、線性范圍、重現(xiàn)性、耐用性等。生物樣品中藥物分析方法評價的標(biāo)準(zhǔn)與上述評價指標(biāo)之間，既有共同點也有其獨特之處，測定方法的效能指標(biāo)可以作為對分析測定方法的評價尺度，也可以作為建立新的測定方法的實驗研究依據(jù)。與其他分析方法相比，體內(nèi)藥物分析方法的可行性和可靠性，需要應(yīng)用若干標(biāo)準(zhǔn)來進(jìn)行方法學(xué)的考察與評價。在實際工作中評價一個體內(nèi)藥物分析方法的優(yōu)劣，一般常用精密度、準(zhǔn)確度、靈敏度、專屬性或選擇性及可測濃度范圍等指標(biāo)進(jìn)行考察。一、生物樣品測定方法的驗證指標(biāo)(一)準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度(accuracy)是指測得結(jié)果與真實值接近的程度，表示分析方法測量的正確性，是考察和評價分析方法的最基本要點之一。由于不可能絕對地確知樣品的“真值”，因而常用回收率數(shù)值反映測定的準(zhǔn)確程度。也可通過與其他已建立的分析方法進(jìn)行比較等手段來反映準(zhǔn)確度?；厥章适侵笇⒁阎康乃幬锛兤芳拥娇瞻咨锘|(zhì)(如空白血漿、血清)中，經(jīng)過一系列的前處理、測定，計算所測得的藥物量與加入量的比值，以百分率表示。一般回收率數(shù)值越接近100％，準(zhǔn)確程度越好。生物藥物分析中，常用標(biāo)準(zhǔn)添加法來計算回收率，即取已準(zhǔn)確測定藥物含量P(present)的真實樣品(如人血漿樣品

等)，再加入藥物標(biāo)準(zhǔn)晶已知量A．(added)，將該混合物作為測定液，其測定值為M(measured)。測定液要配制成高、中、低三種濃度，每個濃度測定3-5次，求出每種濃度的平均測定值M，且RSD應(yīng)符合要求。由于預(yù)先要準(zhǔn)確測定樣品中原含有的藥物量P，因此也應(yīng)測定3-5次，求其平均值P，且RSD也應(yīng)符合要求。按上式計算出的回收率，其結(jié)果越接近100％表明分析方法準(zhǔn)確度越高。生物樣品分析時，一般應(yīng)將回收率范圍控制在85％-115％(樣品藥濃≥2m心L)及80％-120％(樣品藥濃<200t~,／L)o但因生物樣品組分復(fù)雜，藥物含量低，前處理步驟多很難達(dá)到較高的回收率。對一種分析方法來說，更重要的是每次測得的回收率要保持恒定，雖然有時回收率較低，但只要重現(xiàn)性好，通過校正后仍可采用?；厥章矢鶕?jù)測定方法不同，又可分為絕對回收率和方法回收率。1．絕對回收率。絕對回收率又稱為萃取回收率或提取回收率，它反映了一種方法的萃取效率，與生物樣品檢測靈敏度有關(guān)，是評價體內(nèi)藥物分析方法的重要指標(biāo)之一?，F(xiàn)以色譜為例說明絕對回收率的求算過程。分別取一定量被測藥物標(biāo)準(zhǔn)品兩份，其中一份加到空白樣品中，按設(shè)定方法處理、進(jìn)樣測定，測得色譜峰面積為A；另一份用純品溶劑溶解并測稀釋使其濃度與第一份處理后濃度一致，進(jìn)樣測得色譜峰面積為A，真其回收率為：回收率(％)=A／A×100％。絕對回收率應(yīng)考察高、測真中、低三個濃度，高濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限附近，低濃度選擇在定量限附近，中間選一個濃度。對于回收率的大小與變異不宜苛求，一般

添加量在10—10-9g，絕對回收率若能達(dá)到50％—80％，應(yīng)該是令6—人滿意的。色譜分析中采用內(nèi)標(biāo)法測定含量，分別取相同量的藥物標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)兩份。其中一份加到空白樣品中，按設(shè)定方法處理，測得藥物和內(nèi)標(biāo)峰面積，求出它們的比值=A／A。另一份用純?nèi)芩巸?nèi)劑溶液進(jìn)樣，測得藥物和內(nèi)標(biāo)峰面積，計算其比值。然后根據(jù)下式求出回收率：回收率(％)=R／R×100％在內(nèi)標(biāo)法中，要求藥物與內(nèi)測真標(biāo)物各自用外標(biāo)法測得的絕對回收率應(yīng)相近，相差小于10％，否則回收率偏離100％太遠(yuǎn)。2．方法回收率取一系列濃度的藥物標(biāo)準(zhǔn)品加到空白體液中，按設(shè)定的分析方法測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度及相應(yīng)的測定信號值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸、低濃度的藥物標(biāo)準(zhǔn)品加到空白體液每個濃度至少行平測定5份，測得信號值代人回歸方程，求得相應(yīng)的測定值。測得量與加入量比較，即得方法回收率，除定量限外，各濃度點測得的平均值偏離實際加入量應(yīng)少于15％，定量限這一點應(yīng)小于20％。回收率測定時，不管采用哪種方法，要求添加的藥物量必須與實際測量相近，必須與實際存并求出回歸方程，然后取高、中中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法同法測定，在的狀態(tài)相似，必須同時做空白試驗，否則測得結(jié)果不可靠。因此報道一個方法的回收率時，必須說明添加量。(二)精密度(precision)是指同一均質(zhì)樣品的測定結(jié)果與平均值的偏離程度，或者說多次測定結(jié)果彼此符合的程度，它表示分析方法的可重復(fù)性。它有多種表示方法，在體內(nèi)藥物分析中常用以下方法表示。

1．標(biāo)準(zhǔn)差(standarddeviation，SD或S)的計算公式為：SD=2．相對標(biāo)準(zhǔn)差相對標(biāo)準(zhǔn)差(Relative8tandaddeviation，RSD)，也稱變異系數(shù)(CV)的計算公式為RSD=CV/SD×100％。精密度測定通常采用高、中、低三種濃度進(jìn)行測定，高濃度選擇在標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限附近，低濃度選擇在定量限附近，中間選一個濃度。測定時每種濃度的樣品應(yīng)重復(fù)測定3-5次，按上式計算測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差和相對標(biāo)準(zhǔn)差。在定量限外各濃度點RSD不應(yīng)大于15％，最低定量限這一點不應(yīng)大于20％。生物樣品分析時，常用RSD表示精密度，并可分為日內(nèi)(或批內(nèi))精密度和日間(或批間)精密度。日內(nèi)(或批內(nèi))精密度(within—runprecision)考察分析方法在短期內(nèi)測定結(jié)果的變異情況。凡是在同一天內(nèi)將樣品多次測定所計算出的精密度稱為日間精密度；凡在同一批內(nèi)樣品多次測定所計算出的精密度稱為批內(nèi)精密度。所謂“批內(nèi)”是指測定時使用同批試劑、同一條標(biāo)準(zhǔn)曲線等主要條件相同情況下完成的分析測定。所得RSD應(yīng)爭取達(dá)到5％以內(nèi)，最差不能超過10％。日間(或批間)精密度(between—nmprecision)考察分析方法在不同時間測定結(jié)果的變異情況。于由體內(nèi)藥物分析面臨樣品數(shù)量多，測定持續(xù)時間長，往往在同一天或同一批內(nèi)不能完成，樣品測定時使用的儀器性能、試劑、標(biāo)準(zhǔn)曲線及環(huán)境條件等都可能發(fā)生微小的變化，從

而導(dǎo)致分析結(jié)果的變異增大。因此，考察分析方法的精密度時，還應(yīng)考察日間或批間精密度。通常采用高、中、低三種濃度的同一樣品，每種濃度配制7—10份，置冰箱冷凍。白配制樣品之日開始，按所擬定的分析方法操作，每天取出一份測定，計算每種濃度樣品的SD值及RSD值。所得RSD應(yīng)控制在15％以內(nèi)。(三)靈敏度靈敏度是指一種分析方法可檢出有關(guān)化合物的最小量，常用以下三種表示方法：1．檢測限，檢測限(LOD)是指分析方法能夠從背景信號中區(qū)分出藥物時所需樣品中藥物的最低濃度。通常以被測信號和背景噪音比(簡稱信噪比)S／N為2-3倍時的被測物的絕對量來表示，LOD=3N／S(N=噪音，S=被測物信號／單位質(zhì)量)。也可通過多次空白試驗，求得背景響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)差，再乘以2或3作為LOD的估計值。2．定量限定量限(LOQ)是指在保證具有一定可靠性的前提下，分析方法能定量測定出樣品中藥物的最低量。它與檢測限的不同在于定量限規(guī)定的最低測得量應(yīng)該符合一定的精密度和準(zhǔn)確度的要求。在體內(nèi)藥物分析中，通常以標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低濃度點作為定量限。也可以S／N為10或空白背景響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)差乘以10作為估計值，再通過試驗確定。在體內(nèi)藥物分析中，進(jìn)行藥物制劑人體生物利用度和生物等效性測定時，對LOQ的要求至少能滿足測定3-5個半衰期時的樣品中藥物濃度，或C的1／10～1/120時的藥物濃度。max3．最低檢測濃度·最低檢測濃度多指可進(jìn)行定量測定的某一藥物的最低濃度。它與樣品體積大小有關(guān)，可由以下公式求得：

最低檢測濃度=LOQ／進(jìn)樣體積上述表示靈敏度的方法均指儀器的靈敏度，即進(jìn)人儀器的最低絕對量或最低濃度。如果儀器的靈敏度相同，而生物樣品預(yù)處理方法不同，就有可能影響。因此，要提高檢測方法的靈敏度，除了選擇高靈敏度的儀器外，還可采取提高進(jìn)樣量、降低儀器噪音；提高樣品的濃縮程度或降低樣品稀釋度；消除干擾、降低空白值等措施。(四)分析方法的專屬性分析方法的專屬性(specificity)又稱選擇性(selectivity)，通常是指樣品中含有其他共存物質(zhì)時，分析方法能夠準(zhǔn)確、專一地測定出藥物的能力。即測得的響應(yīng)值應(yīng)該是屬于被測物所特有的，否則就易受干擾。在生物藥物分析時，考察一個方法的專屬性或選擇性應(yīng)著重考慮：(1)內(nèi)源性物質(zhì)的干擾：可取空白樣品(如空白血漿)試驗。色譜分析時，要求藥物和內(nèi)標(biāo)峰附近無干擾峰；光譜分析時，要求藥物的測定波長處應(yīng)無雜質(zhì)吸收或熒光。(2)代謝產(chǎn)物是否會干擾原藥的測定響應(yīng)值，可用給藥數(shù)次后病人的尿液(含代謝物)來進(jìn)行試驗。若藥物在體內(nèi)代謝情況為已知，且可獲得代謝物標(biāo)準(zhǔn)品，則可將其加入空白樣品以及加人實際樣品中，驗證是否有干擾。(3)在臨床藥物監(jiān)測時要考慮同時服用藥物的干擾。·專屬性的測定以色譜法為例，通常取空白樣品，采用擬定的方法進(jìn)行測定，所得結(jié)果與接近于定量限的被測物濃度的純?nèi)軇┤芤核媒Y(jié)果進(jìn)行比較。

在藥物、代謝物、內(nèi)標(biāo)物的保留時間處不應(yīng)有大的干擾，任何有大的干擾的空白應(yīng)舍去，需重新改變擬訂的方法，以消除干擾。在報告專屬性時，至少要提供空白生物樣品色譜圖，空白生物樣品加標(biāo)準(zhǔn)品或內(nèi)標(biāo)物色譜圖及服藥后生物樣品的色譜圖。色譜分析除可用色譜圖表明同時服用藥物不干擾外，還可以分別列出這些藥物的保留時間，顯示有無干擾。(五)線性范圍線性范圍(1inearityandrange)是指一種分析方法的精密度、準(zhǔn)確度都符合要求的試驗結(jié)果成線性時供試物濃度的變化范圍。在體內(nèi)藥物分析中，通常是將藥物標(biāo)準(zhǔn)品加入空白體液中，制備標(biāo)準(zhǔn)系列，按擬定分析方法處理、測定，然后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，或計算回歸方程，求出相關(guān)系數(shù)和線性范圍。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備以色譜法為例，一般由一個空白，一個空白樣品加內(nèi)標(biāo)和5-8個濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列組成，要求覆蓋實際的樣品濃度范圍，包括LOQ。空白和空白加內(nèi)標(biāo)不用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，僅作為對于擾的考察。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性程度目前仍廣泛采用相關(guān)系數(shù)(r)表示，一般，不應(yīng)低于0.99，同時必須符合一定的精密度和準(zhǔn)確度。標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)覆蓋樣品可能的濃度范圍，對于含量測定，一般要求濃度上限為樣品最高濃度的120％，下限為樣品最低濃度的80％，但應(yīng)高于LOQ。(六)穩(wěn)定性穩(wěn)定性(stability)是指藥物的穩(wěn)定性，它是貯存條件、藥物的化學(xué)性質(zhì)、空白生物樣品和容器系統(tǒng)的函數(shù)。在實際工作中，首先要考察藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性，其次考察藥物在生物樣品中的穩(wěn)定性。藥物

在生物樣品中的穩(wěn)定性包括：在室溫條件下的穩(wěn)定性要超過在冷凍條件下的穩(wěn)定性；反復(fù)冷凍一解凍條件下的穩(wěn)定性考察。1．短期室溫條件下穩(wěn)定性考察通常取高、低濃度各3份于室溫下放置4-24小時測定，測得結(jié)果均與0小時的進(jìn)行比較。2．長期低溫條件下穩(wěn)定性考察長期貯存時間應(yīng)超過收集第一個樣品至最后一個樣品分析所需要的時間周期。儲存溫度—-般為0~20C，如果需要也可在0~70C貯存。要求高、低濃度至少分別測定3次，測得結(jié)果分別與第一天測得的相應(yīng)濃度的結(jié)果進(jìn)行比較。3．冷凍一解凍穩(wěn)定性考察取高、低濃度樣品至少各完全后，取樣進(jìn)行分析測定，然后再回冷凍狀態(tài)保持12—24小時，如此解凍一冷凍重復(fù)循環(huán)兩內(nèi)標(biāo)的貯存溶6小時內(nèi)的穩(wěn)定性考3份，于20℃左右貯存24小時，取出置室溫放置使自然解凍，當(dāng)融解把樣品放次以上，分別比較各次分析測定的結(jié)果。另外，藥物與液的穩(wěn)定性的考察，一般應(yīng)在室溫條件下進(jìn)行察。然后將其冷藏或冷凍7-14天或恰當(dāng)時期后進(jìn)行測定，將測得結(jié)果與新鮮配制溶液的測得結(jié)果進(jìn)行比較。(七)與參比方法測得結(jié)果的相關(guān)程度的比較由于生物樣品中含有許多干擾測定的雜質(zhì)，特別是與原型藥物相似的代謝物常對藥物的測定有影響。因此，除考察選擇性外，有時還用參比方法對實際生物樣品同時測定并進(jìn)行比較。比較試驗時，取若

干份實際樣品(如病人服藥后采取的血樣)，用一個已證明有相當(dāng)專屬性和可靠性的方法與新建立的方法同時進(jìn)行測定，以參比方法測得的藥物濃度為橫坐標(biāo)(X)，以新建立方法測得的藥物濃度為縱坐標(biāo)(Y)做成散布圖(scatterdiagram)，并求出直線回歸方