研究目的

探討分子生物學(xué)研究中腫瘤庫(kù)的建庫(kù)條件，標(biāo)本的采集、保存和質(zhì)量控制，以及腫瘤庫(kù)的信息化管理等有關(guān)問(wèn)題，創(chuàng)建腫瘤組織標(biāo)本庫(kù)，保護(hù)和合理利用腫瘤的標(biāo)本資源，為臨床和科學(xué)研究人員，提供合適數(shù)量的腫瘤標(biāo)本促進(jìn)腫瘤的研究。現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有23頁(yè)\編輯于星期二目錄建庫(kù)理論基礎(chǔ)材料與方法結(jié)果討論致謝現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有23頁(yè)\編輯于星期二理論基礎(chǔ)一、建立組織庫(kù)的三種模式1.“銀行”模式2.臨床試驗(yàn)?zāi)Ｊ?.前瞻性收集模式現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有23頁(yè)\編輯于星期二理論基礎(chǔ)“銀行”模式的組織庫(kù)：按照一定的標(biāo)準(zhǔn)化運(yùn)轉(zhuǎn)程序（standardoperatingprocesseds,SOPs）規(guī)范人體組織的收集、加工和儲(chǔ)存。組織標(biāo)本形式：通常為低溫冷凍組織或蠟塊。缺點(diǎn)：不能提供新鮮的、未被冰凍的人體組織，亦不能提供某些有特殊加工需求的組織樣本。不能滿足研究者對(duì)組織塊的個(gè)性化需求。優(yōu)點(diǎn)：可向研究者提供大量的組織樣本，并且這些組織均有相關(guān)的臨床信息和流行病學(xué)信息。現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有23頁(yè)\編輯于星期二理論基礎(chǔ)臨床試驗(yàn)?zāi)Ｊ剑菏恰便y行“模式的一個(gè)亞型，是由一個(gè)或多個(gè)臨床試驗(yàn)收集的標(biāo)本構(gòu)成的標(biāo)本庫(kù)。缺點(diǎn)：其內(nèi)組織標(biāo)本的應(yīng)用受限于倫理委員會(huì)的要求，無(wú)法被廣泛的應(yīng)用與其他臨床研究。同樣，組織的大小、采集及加工的方法也不能滿足所有研究者的需求?，F(xiàn)在是5頁(yè)\一共有23頁(yè)\編輯于星期二理論基礎(chǔ)前瞻性收集模式：研究者指定需要的組織類型，同時(shí)也制定出所需的組織采集、處理及儲(chǔ)存方法。缺點(diǎn)：沒(méi)有現(xiàn)成的大量的組織標(biāo)本以及臨床資料，因?yàn)榻M織需要前瞻性的去收集。優(yōu)點(diǎn)：研究者能獲得他們需要的組織樣本，能夠滿足其研究的個(gè)性化需求?，F(xiàn)在是6頁(yè)\一共有23頁(yè)\編輯于星期二理論基礎(chǔ)二、組織收集盡量縮短和記錄手術(shù)摘除或從手術(shù)室轉(zhuǎn)移到標(biāo)本庫(kù)的時(shí)間間隔很重要Spruessel等人報(bào)道，組織離體后30分鐘內(nèi)稱80%基因變化少于2個(gè)折疊[1]

Maine等人報(bào)道，前列腺組織離體1小時(shí)內(nèi)僅有不到1%基因發(fā)生了變化[2]

術(shù)后標(biāo)本在體外保存5分鐘和60分鐘相比，其mRNA變化不明顯[3]1.SpruesselA,SteinmannG,JungM,LeeSA,CarrT,FentzAJ,SpangenbergJ,ZornigC,JuhlHH,DavidKA.Tissueischemiatimeaffectsgeneandproteinexpressionpatternswithinminutesfollowingsurgicaltumorexcision.

Biotechniques.

2004;36(6):1030–1037.2.MaineIP,VaramballyS,ShenR,ChinnaiyanM,RubinMA.Changesindifferentialgeneexpressionbecauseofwarmischemiatimeofradicalprostatectomyspecimens.

AmJPathol.2002;161(5):1743–1748.3.HuangJ,QiR,QuackenbushJ,DauwayE,LazaridisE,YeatmanT.Effecsofischemiaongeneexpression.

JSurgRes.

2001;99:222–227.現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有23頁(yè)\編輯于星期二理論基礎(chǔ)三、組織儲(chǔ)存北京大學(xué)季加孚等研究發(fā)現(xiàn)：手術(shù)后1h內(nèi)取材的組織經(jīng)過(guò)3年低溫保存，90％以上的標(biāo)本仍有清晰的28S和18SRNA條帶，提示RNA完整性較好[4]DNA分子穩(wěn)定性較mRNA好，在-80℃環(huán)境中保存5年，DNA完整性良好[5]4.季加孚．北京大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院腫瘤標(biāo)本庫(kù)的建設(shè)[J]．北京大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2005，37(3)：329—330．5.張佳年，于穎彥，計(jì)駿.等.低溫凍存時(shí)間對(duì)腫瘤組織生物大分子的影響[J].診斷學(xué)理論與實(shí)踐2009，V01．8，No1現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有23頁(yè)\編輯于星期二材料與方法腫瘤組織庫(kù)庫(kù)房，放置液氮罐、冰箱、冰柜等冷凍設(shè)備，用于存放標(biāo)本；分子生物室（中心實(shí)驗(yàn)室）用于提取血清、血漿、分離淋巴細(xì)胞。庫(kù)房設(shè)備：液氮罐1個(gè)（YDS-30，沈陽(yáng)新光），-80℃立式超低溫保存箱2臺(tái)（DW-86L628，青島海爾），4℃～-20℃冰柜1臺(tái)（BCD-130Eb，青島海爾）；聯(lián)想電腦、條碼掃描器、條碼打印機(jī)1套（BP-IP300，德國(guó)BRADY）等?，F(xiàn)在是9頁(yè)\一共有23頁(yè)\編輯于星期二庫(kù)房現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有23頁(yè)\編輯于星期二生物樣本庫(kù)資源信息管理系統(tǒng)現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有23頁(yè)\編輯于星期二主要設(shè)備BRADY條碼打印機(jī)液氮罐海爾-80℃冰箱現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有23頁(yè)\編輯于星期二患者入院后行生物安全性檢查。檢測(cè)HIV以及嗜肝病毒HBV及HCV感染情況。HIV感染患者不列為采集對(duì)象。HBV及HCV感染者需在標(biāo)本上明確注明。尊重患者的知情權(quán)和隱私權(quán)，在向患者及家屬介紹標(biāo)本采集和使用目的，獲得患者自愿簽署知情同意書后，方可安排標(biāo)本采集和數(shù)據(jù)錄入?，F(xiàn)在是13頁(yè)\一共有23頁(yè)\編輯于星期二組織采集手術(shù)結(jié)束后，標(biāo)本離體30分鐘內(nèi)完成，在臨床腫瘤專家的指導(dǎo)下，在不影響病理診斷取材需要的前提下，采集組織樣本。1）標(biāo)本取材部位：腫瘤組織、癌旁組織（癌組織旁1cm）和正常組織（癌組織旁5cm及以外或最遠(yuǎn)處）。2）過(guò)程：使用數(shù)碼相機(jī)拍攝標(biāo)本外觀后，將標(biāo)本切成小塊（直徑0.5×0.5cm，厚度＜0.5cm），為減少處理時(shí)間，標(biāo)本不應(yīng)切得太小，然后放入無(wú)菌凍存管內(nèi)，做好標(biāo)記，記錄標(biāo)本采集的時(shí)間及標(biāo)本的類型。每例病人樣本保存3~5份凍存管標(biāo)本。每份組織重量原則不低于2g。3）標(biāo)本凍存管標(biāo)記后直接凍存于液氮中，后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中。標(biāo)本運(yùn)送過(guò)程中，將其置于冰中保存?，F(xiàn)在是14頁(yè)\一共有23頁(yè)\編輯于星期二術(shù)前血：指臨床診斷明確，患者未經(jīng)任何治療，即放療、化療及免疫治療等，已接受上述治療的患者樣本需詳細(xì)注明。術(shù)后血：指接受手術(shù)后2周，患者未接受任何放療、化療或免疫治療等?，F(xiàn)在是15頁(yè)\一共有23頁(yè)\編輯于星期二1、取血液標(biāo)本，每例采集10ml（不少于5ml），約10ml全血平均分裝于紅帽管（不含抗凝劑，1管）和紫帽管（含2%EDTA抗凝劑，2管）中。2、紅帽管用于分離血清，室溫放置30分鐘后離心；紫帽管用于分離血漿及淋巴細(xì)胞。3、1500r/min離心10分鐘，此時(shí)懸液分層，上層淡黃色為血清（紅帽管）或血漿（紫帽管），底層為紅細(xì)胞，紫帽管中中層呈灰白色的為外周血淋巴細(xì)胞。4、輕輕吸取淡黃色上層血清（血漿）放入1.5ml離心管中，每管200μl，共12管（血清6管，血漿6管），做好標(biāo)記。5、新鮮抗凝血（含2%EDTA抗凝）去血漿后，按照1:1比例加入PBS液混勻。6、15ml離心管內(nèi)先加入3ml淋巴細(xì)胞分離液，后加入6ml稀釋樣品，注意加入樣品要緩慢進(jìn)行，不要沖破液面，影響離心效果。20±2℃下2000r/min離心20分鐘。7、離心后血樣分四層，將移液管插入液面，輕吸灰白色的淋巴細(xì)胞層，放入另一15ml離心管中，注意吸取過(guò)程中避免吸入分層液和血漿。8、按1:5的比例向淋巴細(xì)胞中加入PBS液，混勻洗滌，室溫1000r/min離心10min。9、棄去上清液保留底部沉淀，適用1.5mlPBS液吹打洗滌，置入標(biāo)記好的1.5ml細(xì)胞凍存管中，高速離心機(jī)500r/min離心5分鐘。10、棄去上清液保留底部沉淀，血清、血漿及淋巴細(xì)胞分裝完畢后貼好二維標(biāo)簽?，F(xiàn)在是16頁(yè)\一共有23頁(yè)\編輯于星期二質(zhì)量控制樣本DNA完整性檢測(cè)方法一：提取樣本基因組DNA，檢測(cè)OD260/OD280值。進(jìn)行0.7%瓊脂糖凝膠電泳。通過(guò)DNA電泳判斷組織標(biāo)本的基因組是否完整。無(wú)基因組DNA或DNA出現(xiàn)明顯降解為不可用樣本。方法二：通過(guò)PCR選擇擴(kuò)增管家基因，如GAPD、HHPRT、β-actin，分析擴(kuò)增產(chǎn)物的含量。產(chǎn)物含量相對(duì)較少或無(wú)產(chǎn)物，可判斷為不可使用標(biāo)本。現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有23頁(yè)\編輯于星期二質(zhì)量控制樣本RNA完整性檢測(cè)方法一：參照Trizol試劑盒操作指南進(jìn)行組織總RNA的提取。應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)260nm、280nmOD值定量分析RNA（OD260/OD280為）；1%瓊脂糖凝膠電泳后觀察5S、18S和28S條帶情況。28S和18S條帶亮度的比值約2:1，表明標(biāo)本中的RNA完整性較好。出現(xiàn)降解者為不可用樣本。方法二：RT-PCR擴(kuò)增β-actin、HHPRT管家基因，分析擴(kuò)增產(chǎn)物的含量，產(chǎn)物含量相對(duì)較少或無(wú)產(chǎn)物可判斷為不可用樣本。方法三：NorthernBlot檢測(cè)β-actin、HHPRT管家基因，無(wú)印記者列為不可使用樣本。現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有23頁(yè)\編輯于星期二蛋白質(zhì)完整性檢測(cè)蛋白質(zhì)完整性通過(guò)WesternBlot進(jìn)行檢測(cè)，檢查標(biāo)本樣本中β-actin的蛋白表達(dá)量變化，通過(guò)分析印記條帶，判斷蛋白量是否有變化，無(wú)條帶或條帶變?nèi)跽邽榘l(fā)生組織降解樣本?，F(xiàn)在是19頁(yè)\一共有23頁(yè)\編輯于星期二結(jié)果自2010年7月建庫(kù)以來(lái)共收集保存了各類腫瘤（胃癌、結(jié)腸癌、直腸癌、甲狀腺癌、胃腸道間質(zhì)瘤等）患者的組織標(biāo)本1333例，胃癌患者424例，直腸癌267例，結(jié)腸癌246例，甲狀腺腫瘤254例，胃腸道間質(zhì)瘤45例，其他類型腫瘤97例。標(biāo)本總量11919份，其中包括腫瘤組織1170份，腫瘤旁組織900份，正常組織1113份，血清3923份，血漿3931份，淋巴細(xì)胞843份，糞便39份。已向外省提供60份患者血淋巴細(xì)胞樣本，用于DNA相關(guān)研究，效果良好?，F(xiàn)在是2