現(xiàn)代物技術(shù)在發(fā)酵工業(yè)應(yīng)用第1頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日

植物中含有數(shù)量極為可觀的次代謝物質(zhì)。據(jù)保守的估計(jì)，目前已發(fā)現(xiàn)的植物天然代謝物已超過2萬種，而且還在以每年新發(fā)現(xiàn)1600種的速度遞增。我們祖先在與疾病的抗?fàn)幹幸迅鞣e累了豐富的利用植物中的生物活性物質(zhì)治病強(qiáng)身的經(jīng)驗(yàn)。李時(shí)珍（1953）編纂的巨著《本草綱目》中所開列的1892種藥物絕大多數(shù)是植物。目前仍約25%的法定藥品來自植物。然而植物生長縵慢，自然災(zāi)害頻繁。即使是大規(guī)模人工栽培仍然不能從根本上滿足人類對經(jīng)濟(jì)植物日益增長的需求。因此早在1956年，Routier和Nickell就提出工業(yè)化培養(yǎng)植物細(xì)胞以提取其天然產(chǎn)物的大膽設(shè)想第2頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日Reinhard等（1968）首先將這種設(shè)想轉(zhuǎn)變成現(xiàn)實(shí)，生產(chǎn)出了哈爾堿(harmine)。緊接著Kaul等（1969）、Furrya等(1972)和Teuscher等（1973）分別培養(yǎng)植物細(xì)胞獲取了其中的薯蕷(yu山藥）皂苷、人參皂角苷和維斯納精（visnagin）?，F(xiàn)在一些發(fā)達(dá)國家已集中相當(dāng)數(shù)量的人力、財(cái)力潛心開拓這個經(jīng)濟(jì)潛力十分巨大的生產(chǎn)領(lǐng)域。目前世界最大批量工業(yè)化培養(yǎng)細(xì)胞（煙草細(xì)胞）已達(dá)2萬升（20噸）。我國在“八五”、“九五”和“863計(jì)劃”中連續(xù)撥款資助工業(yè)化培養(yǎng)紅豆杉細(xì)胞生產(chǎn)抗腫瘤藥物紫杉醇的研究，目前已達(dá)到60mg/L的世界先進(jìn)水平。第3頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日

植物細(xì)胞培養(yǎng)是指在離體條件下將愈傷組織或其他易分散的組織置于液體培養(yǎng)基中，將組織振蕩分散成游離的懸浮細(xì)胞，通過繼代培養(yǎng)使細(xì)胞增殖來獲得大量細(xì)胞群體的方法。植物受創(chuàng)傷后，在傷面新生的組織稱為愈傷組織,在植物組織培養(yǎng)中的愈傷組織是指植物細(xì)胞在組織培養(yǎng)過程中形成的無一定結(jié)構(gòu)的組織團(tuán)塊，在適宜的條件下，愈傷組織可再分化形成芽、根，再生成植株.第4頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日

鑒于有些產(chǎn)物的唯一來源只能是植物，而許多有價(jià)值的植物只能生長在某一特定的地理區(qū)域，且受到很多自然條件的限制和影響，尤其是有些植物從種植到收獲要花幾年時(shí)間，很難滿足需要。采用大規(guī)模植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)就可以直接生產(chǎn)這些產(chǎn)物。如可作為藥物和染料的紫草寧就是典型的通過大規(guī)模植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的產(chǎn)品，通過大規(guī)模培養(yǎng)紫草細(xì)胞短時(shí)間內(nèi)就可大量生產(chǎn)紫草寧。表12-1是植物細(xì)胞培養(yǎng)和從完整的植物生產(chǎn)紫草寧的比較。第5頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日

表12-1:植物細(xì)胞培養(yǎng)和從完整的植物生產(chǎn)紫草寧的比較目前，植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、化妝品、香料等領(lǐng)域廣泛用于大規(guī)模生產(chǎn)有價(jià)值的產(chǎn)品。小規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)通?？梢栽谂囵B(yǎng)瓶中完成，而大規(guī)模的培養(yǎng)可在發(fā)酵罐中進(jìn)行。生產(chǎn)方式收獲時(shí)間紫草寧濃度（%干重）完整植物2-3a1-2植物細(xì)胞培養(yǎng)21d14第6頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日7.3.1植物細(xì)胞培養(yǎng)基與動物細(xì)胞培養(yǎng)相比，植物細(xì)胞培養(yǎng)的最大優(yōu)點(diǎn)是植物細(xì)胞可以在簡單的合成培養(yǎng)基上正常生長。用于植物細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分基本上與整個植物的要求一樣，但是用于培養(yǎng)細(xì)胞、組織和器官的培養(yǎng)基需要滿足各自的特殊要求。根據(jù)特定的植物種類和培養(yǎng)系統(tǒng)，培養(yǎng)基的基本營養(yǎng)成分可作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。第7頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日植物細(xì)胞培養(yǎng)基通常包括無機(jī)鹽、碳源、維生素、生長調(diào)節(jié)素和有機(jī)添加劑等。無機(jī)鹽類:微量元素主要包括碘、硼、錳、鋅、鉬、銅、鈷、鐵等。碳源和能源:葡萄糖、蔗糖、維生素:植物細(xì)胞的生長都需要硫胺素?？稍谥参锛?xì)胞培養(yǎng)基中加入煙酸、吡哆醇、泛酸、生物素和葉酸等。原生質(zhì)體培養(yǎng)通常需要大多數(shù)必需維生素。第8頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日植物生長激素：大多數(shù)植物細(xì)胞培養(yǎng)基中都含有天然的或合成的植物生長激素。生長激素包括了植物生長素、細(xì)胞激動素、赤霉素和脫落酸等四大類。有機(jī)氮源：通常采用的有機(jī)氮源有蛋白質(zhì)水解物、谷氨酰胺或氨基酸混合物等。有機(jī)酸：加入丙酮酸，或者檸檬酸、蘋果酸和琥珀酸等三羥酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，能夠保證植物細(xì)胞在以銨鹽作為單一氮源的培養(yǎng)基上生長，并且使細(xì)胞對鉀鹽的耐受能力提高。除此之外，這些有機(jī)酸還能提高低密度接種的細(xì)胞和原生質(zhì)體的生長。復(fù)合物質(zhì)：在植物細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，酶母抽提液、麥芽抽提液、椰子汁和水果汁等復(fù)合物質(zhì)通?？梢宰鳛榧?xì)胞的生長劑。第9頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日

7.3.2植物細(xì)胞培養(yǎng)方法（1）固體培養(yǎng)：固體培養(yǎng)是在微生物培養(yǎng)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的植物細(xì)胞培養(yǎng)方法。固體培養(yǎng)基的凝固劑除特殊研究外，幾乎都使用瓊脂，濃度一般為6%-10%。接種材料放在培養(yǎng)基上，原生質(zhì)體固體培養(yǎng)則需混入培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行嵌合培養(yǎng)，或者使原生質(zhì)體在固體-液體之間進(jìn)行雙相培養(yǎng)。第10頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日

（2）懸浮培養(yǎng)：植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)是一種使組織培養(yǎng)物分離成單細(xì)胞并不斷擴(kuò)增的方法。在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，需要提供容易破裂的愈傷組織進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)，愈傷組織經(jīng)過懸浮培養(yǎng)可以產(chǎn)生比較純一的單細(xì)胞。用于懸浮培養(yǎng)的愈傷組織應(yīng)該是易碎的，這樣在液體培養(yǎng)條件下能獲得分散的單細(xì)胞，而緊密不易碎的愈傷組織就不能達(dá)到上述目的。第11頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日

（3）固定化培養(yǎng)固定化培養(yǎng)是在微生物和酶的固定化培養(yǎng)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的植物細(xì)胞培養(yǎng)方法。該法與固定化酶或微生物細(xì)胞類似，應(yīng)用最廣泛的、能夠保持細(xì)胞活性的固定化方法是將細(xì)胞包埋于海藻酸鹽或卡拉膠中。第12頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日7.3.3植物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)目前用于植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的技術(shù)主要有植物細(xì)胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)和植物細(xì)胞或原生質(zhì)體的固定化培養(yǎng)。前者適于大量快速地增殖細(xì)胞，但往往不利于次生物質(zhì)的積累；后者則相反，細(xì)胞生長緩慢而次生物質(zhì)含量相對較高。第13頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日

（1）植物細(xì)胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)

1953年Muir成功地對煙草和直立萬壽菊的愈傷組織進(jìn)行了懸浮培養(yǎng)。繼之Tulecke和Nickell（1959）推出了一個20L的植物細(xì)胞封閉式懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)。經(jīng)蒸汽滅菌后接入目的培養(yǎng)物，以無菌壓縮空氣進(jìn)行攪拌。當(dāng)營養(yǎng)耗盡，細(xì)胞數(shù)目不再增加且次生物質(zhì)達(dá)一定含量時(shí)，收獲細(xì)胞，提取產(chǎn)物。他們用此系統(tǒng)成功地培養(yǎng)了銀杏、冬青、黑麥草和薔薇等細(xì)胞。結(jié)構(gòu)簡單，易于操作是本系統(tǒng)的突出優(yōu)點(diǎn)。但它的生產(chǎn)效率不夠高，次生物質(zhì)累積的量也較少。第14頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日

（2）植物細(xì)胞或原生質(zhì)體的固定化培養(yǎng)細(xì)胞固定化是將細(xì)胞包埋在惰性支持物的內(nèi)部或貼附在它的表面。其前提就是通過懸浮培養(yǎng)獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞。由于固定化植物細(xì)胞培養(yǎng)比自由懸浮細(xì)胞培養(yǎng)具有較高的機(jī)械穩(wěn)定性、產(chǎn)率，更長的穩(wěn)定（生產(chǎn)期）等許多優(yōu)點(diǎn)，因此，通常采用固定化來進(jìn)行植物細(xì)胞的培養(yǎng)。這類培養(yǎng)包括了植物細(xì)胞和原生質(zhì)體的固定化培養(yǎng)。第15頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日7.4固定化酶和細(xì)胞固定化酶(ImmobilizedEnzyme）是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的—項(xiàng)新技術(shù)。以往使用的酶絕大多數(shù)是水溶性的酶。這些水溶性酶催化結(jié)束后，極難回收，因而阻礙了酶工業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。60年代后，在酶學(xué)研究領(lǐng)域內(nèi)涌現(xiàn)出固定化酶。它是通過物理的或化學(xué)的手段，將酶束縛于水不溶的載體上，或?qū)⒚讣砜`在一定的空間內(nèi)，限制酶分子的自由流動，但能使酶充分發(fā)揮催化作用；過去曾稱其為水不溶酶或固相酶。1971年第一屆國際酶工程會上正式建議采用固定化酶的名稱。第16頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日7.4.1固定化酶與固定化細(xì)胞的優(yōu)缺點(diǎn)

固定化酶:

固定化酶的研究已取得大量重要成果．發(fā)揮著巨大作用，受到人們極大的關(guān)注。其重要原因是它和水溶性酶比較具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開；產(chǎn)物溶液中沒有酶的殘留，簡化了提純工藝.(2)可以在較長時(shí)間內(nèi)反復(fù)使用，有利于工藝的連續(xù)化、管道化。

(3)酶反應(yīng)過程可以嚴(yán)格控制，有利于工藝自動化和微電腦化。

(4)在絕大多數(shù)情況下提高了酶的穩(wěn)定性。

(5)酶的使用效率提高，產(chǎn)物得率提高，產(chǎn)品質(zhì)量有保障，成本低。第17頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日

固定化酶也存在一些缺點(diǎn)：

(1)酶固定化時(shí)酶的活力有所損失。同時(shí)也增加了固定化的成本，使工廠開始投資大。

(2)比較適應(yīng)水溶性底物和小分子底物。

(3)與完整細(xì)胞比較，不適于多酶反應(yīng)，特別是需要輔助因子的反應(yīng)，同時(shí)對胞內(nèi)酶需經(jīng)分離后．才能固定化。第18頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日

固定化細(xì)胞：固定化細(xì)胞是在固定化酶的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。它的優(yōu)點(diǎn)如下:(1)省去了酶的分離手續(xù)．為多酶系統(tǒng)，無須輔助因子再生。

(2)細(xì)胞生長快、而且多、反應(yīng)快。

(3)可以連續(xù)發(fā)酵，節(jié)約了成本，而且在蒸餾和提取前不用分離去細(xì)胞，能一邊排出發(fā)酵液，一邊進(jìn)行培養(yǎng)，排除了產(chǎn)物抑制和消耗。

(4)保持酶在細(xì)胞內(nèi)的原始狀況，增加了酶的穩(wěn)定、特別是對污染因子的抵抗力增加。第19頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日

固定化細(xì)胞同時(shí)也存在—些缺點(diǎn)：

(1)必須保持菌體的完整，防止菌體自溶，否則，將影響產(chǎn)品純度。

(2)必須防止細(xì)胞內(nèi)蛋白酶對所需酶的分解，同時(shí)，需抑制胞內(nèi)其他酶的活性止副產(chǎn)物的形成。

(3)細(xì)胞膜、壁會阻礙底物滲透和擴(kuò)散。第20頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日

7.4.2酶的固定化方法酶的固定化方法有：吸附法；共價(jià)鍵結(jié)合法；交聯(lián)法；包埋法（1）吸附法利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上，而使酶固定化的方法。常用的固體吸附劑有活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石等。吸附法操作簡便，條件溫和，不會引起酶變性失活，載體廉價(jià)易得，而且可反復(fù)使用。由于靠物理吸附作用，結(jié)合力較弱，酶與載體結(jié)合不牢固而容易脫落，所以使用受到一定的限制。第21頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日（2）包埋法將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法。包埋法使用的多孔載體主要有：瓊脂、瓊脂糖、海藻酸鈉、角叉菜膠、明膠、聚丙烯酰胺、光交聯(lián)樹脂、聚酰胺、火棉膠等。根據(jù)載體材料和方法的不同，可分為：半透膜包埋法：將酶包埋在由各種高分子聚合物制成的小球內(nèi)，制成固定化酶。常用于制備固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉膠膜等第22頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日

凝膠包埋法：將酶或含酶菌體包埋在各種凝膠內(nèi)部的微孔中，制成一定形狀的固定化酶或固定化含酶菌體。大多數(shù)為球狀或片狀，也可按需要制成其他形狀。常用的凝膠有瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠、明膠等天然凝膠以及聚丙烯酰胺凝膠、光交聯(lián)樹脂等合成凝膠。首先被采用包埋法的是：固定化胰蛋白酶木瓜蛋白酶

－淀粉酶第23頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日

海藻酸鈣包埋法裝置：

將水溶性的海藻酸鈉配成水溶液，并把酶或細(xì)胞分散在其中，然后將其滴入凝固液中（常用CaCl2溶液），使海藻酸鈉中的Na+，部分被Ca2+所取代而形成由多價(jià)離子交聯(lián)的離子網(wǎng)絡(luò)凝膠。第24頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日

（3）共價(jià)鍵結(jié)合法通過共價(jià)鍵將酶與載體結(jié)合的固定化方法稱為共價(jià)鍵結(jié)合法。共價(jià)鍵結(jié)合法所采用的載體主要有：纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、甲殼質(zhì)、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等。酶分子中可以形成共價(jià)鍵的基團(tuán)主要有：氨基、羧基、巰基、羥基、酚基和咪唑基等。要使載體與酶形成共價(jià)鍵，必須首先使載體活化，第25頁，共28頁，2023年，2月20日，