真菌感染實(shí)驗(yàn)診斷第1頁(yè)，共36頁(yè)，2023年，2月20日，星期一一、真菌的形態(tài)特性（一）單細(xì)胞真菌呈圓形，如酵母菌。（二）多細(xì)胞真菌由菌絲和孢子組成，稱絲狀菌或霉菌。

第2頁(yè)，共36頁(yè)，2023年，2月20日，星期一菌絲和孢子的形態(tài)因菌而異，是鑒定真菌的重要依據(jù)。孢子又分為多種，如葉狀孢子、分生孢子和孢子囊孢子等。第3頁(yè)，共36頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

二、真菌菌落特性真菌培養(yǎng)要求不高，常用沙氏(Sabouraud)培養(yǎng)基(含1％蛋白胨、4％葡萄糖或麥芽糖、2％瓊脂)培養(yǎng)，適宜溫度22℃—28℃，但深部真菌為37℃。形成三種菌落，菌落形態(tài)是鑒別真菌的重要依據(jù)。第4頁(yè)，共36頁(yè)，2023年，2月20日，星期一1．酵母型菌落是單細(xì)胞真菌的菌落，形態(tài)與細(xì)菌菌落相似，較大，表面光滑濕潤(rùn)柔軟、邊緣整齊，如新生隱球菌。第5頁(yè)，共36頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.類酵母型菌落如白假絲酵母菌，形成假菌絲，伸人培養(yǎng)基中。第6頁(yè)，共36頁(yè)，2023年，2月20日，星期一3．霉菌型菌落是多細(xì)胞真菌的菌落。菌落呈棉絮狀、絨毛狀，并產(chǎn)生不同的色素，如皮膚癬菌。第7頁(yè)，共36頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第二節(jié)標(biāo)本采集及檢驗(yàn)程序

一、臨床標(biāo)本的采集

(一)臨床標(biāo)本類別

1．皮膚的角質(zhì)性物質(zhì)：毛發(fā)、指(趾)甲、皮屑等。第8頁(yè)，共36頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2．各種分泌物和排泄物：生殖道分泌物、耳垢、痰、糞便、尿液等。第9頁(yè)，共36頁(yè)，2023年，2月20日，星期一3．血液和體液：體液包括胸水、腹水、腦脊液、淋巴穿刺液等。4．膿汁及滲出物。第10頁(yè)，共36頁(yè)，2023年，2月20日，星期一(二)采集標(biāo)本注意事項(xiàng)1.采集的標(biāo)本要適宜不同真菌感染應(yīng)采取不同的臨床標(biāo)本。懷疑為淺部真菌感染如體癬，應(yīng)刮取病變邊緣的痂、皮屑，發(fā)癬應(yīng)取病發(fā)。深部真菌感染應(yīng)取血液、腦脊液、膿汁等。第11頁(yè)，共36頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2．在用藥前采集標(biāo)本一般真菌標(biāo)本須在用藥前采集，對(duì)已用藥者則需停藥一段時(shí)間后再采集標(biāo)本。第12頁(yè)，共36頁(yè)，2023年，2月20日，星期一3．采集的標(biāo)本量要足血液和腦脊液標(biāo)本5ml，胸腔液20ml，皮屑標(biāo)本兩塊，活體組織兩份

(一份送病理科檢查，一份作鏡檢和培養(yǎng))。第13頁(yè)，共36頁(yè)，2023年，2月20日，星期一4．嚴(yán)格無(wú)菌操作并進(jìn)行消毒處理，尤其是采集血液和腦脊液標(biāo)本，要避免污染雜菌。5．采集標(biāo)本立即送檢深部真菌標(biāo)本最長(zhǎng)不得超過(guò)2h。第14頁(yè)，共36頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第三節(jié)真菌檢驗(yàn)一、標(biāo)本直接檢查

(一)顯微鏡檢查直接鏡檢對(duì)真菌病的診斷較細(xì)菌更為重要。許多真菌標(biāo)本不需染色即可直接鏡檢，如癬病標(biāo)本多用KOH濕片檢查法，即取病發(fā)或病損部位皮屑、甲屑置于載玻片上，加1滴10％-20％KOH

液，然后加蓋玻片并微微加熱，使標(biāo)本組織溶解透明，在顯微鏡下可觀察到真菌的孢子和菌絲。第15頁(yè)，共36頁(yè)，2023年，2月20日，星期一直接鏡檢的意義直接鏡檢陽(yáng)性表示：①有診斷意義，如淺部真菌病等；②看到的就是真菌的形態(tài)，可確定某些致病性真菌的屬或種,如假絲酵母菌的厚膜孢子等；第16頁(yè)，共36頁(yè)，2023年，2月20日，星期一③判斷某些真菌種的致病性等,如皮膚癬菌、曲霉等。第17頁(yè)，共36頁(yè)，2023年，2月20日，星期一直接鏡檢也有局限性：①陰性結(jié)果不能排除真菌感染；②有假陽(yáng)性結(jié)果。因此，對(duì)直接鏡檢可疑結(jié)果應(yīng)作復(fù)查或用其他檢驗(yàn)方法鑒定。第18頁(yè)，共36頁(yè)，2023年，2月20日，星期一(二)抗原檢測(cè)

常用的方法有膠乳凝集試驗(yàn)、ELISA、半定量放射免疫法。均應(yīng)設(shè)對(duì)照，防止發(fā)生假陽(yáng)性和假陰性。第19頁(yè)，共36頁(yè)，2023年，2月20日，星期一用膠乳凝集試驗(yàn)檢測(cè)標(biāo)本中的白假絲酵母菌甘露聚糖抗原。用膠乳凝集試驗(yàn)和ELISA檢測(cè)血清和腦脊液中的隱球菌多糖莢膜抗原，在治療前檢測(cè)非常敏感特異。第20頁(yè)，共36頁(yè)，2023年，2月20日，星期一用半定量放射免疫法檢測(cè)血清、尿液和腦脊液中莢膜組織胞漿菌循環(huán)多糖抗原，可快速診斷。第21頁(yè)，共36頁(yè)，2023年，2月20日，星期一二、真菌的分離培養(yǎng)

真菌培養(yǎng)是目前鑒定真菌的惟一方法。培養(yǎng)真菌的溫度為28℃，但深部真菌為37℃。菌落是鑒別真菌的方法。注意以下幾點(diǎn)：第22頁(yè)，共36頁(yè)，2023年，2月20日，星期一①菌落性質(zhì)：酵母菌還是霉菌；②菌落大小，病原性真菌菌落小，而條件致病性真菌菌落大；第23頁(yè)，共36頁(yè)，2023年，2月20日，星期一③菌落顏色病原性真菌顏色淡，污染真菌顏色深；④致病性真菌菌落下沉，有時(shí)使培養(yǎng)基開裂；污染性真菌菌落不下沉,很少引起開裂。第24頁(yè)，共36頁(yè)，2023年，2月20日，星期一三、真菌的生化反應(yīng)用于主要深部感染真菌如假絲酵母菌、隱球菌等。1.糖(醇)類發(fā)酵試驗(yàn)37℃孵育，觀察糖發(fā)酵情況。第25頁(yè)，共36頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.同化碳源試驗(yàn)含菌生理鹽水與已融化的固體同化碳源培養(yǎng)基(45℃)混合，然后在培養(yǎng)基上分別加糖，置25℃孵育觀察結(jié)果。若24h后無(wú)變化可重復(fù)加糖。如能同化周圍有生長(zhǎng)圈，否則無(wú)生長(zhǎng)。第26頁(yè)，共36頁(yè)，2023年，2月20日，星期一3.同化氮源試驗(yàn)同化碳源試驗(yàn)相同，但需用無(wú)氮源的培養(yǎng)基，不要加糖類，而加入硝酸鉀。第27頁(yè)，共36頁(yè)，2023年，2月20日，星期一四、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)的目的是分離病原性真菌、確定真菌菌種的致病性、研究藥物對(duì)真菌的作用等。如假絲酵母菌接種家兔或小白鼠，腎臟明顯腫脹，腎皮質(zhì)部位有白色膿瘍。第28頁(yè)，共36頁(yè)，2023年，2月20日，星期一五、核酸檢測(cè)

醫(yī)學(xué)真菌的鑒定手段引入了分子生物學(xué)的鑒定方法，從核酸堿基G+Cmol％分析、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、Southern印跡分析到脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)、PCR指紋、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)以及DNA特殊片段測(cè)序等。第29頁(yè)，共36頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（一)G+Cmol％分類鑒定法

常用熱變性溫度法。原理是DNA加熱變性使堿基氫鍵被打開，雙鏈螺旋變成單鏈，導(dǎo)致核苷酸堿基在260nm紫外吸收明顯增加，完全變成單鏈后，紫外吸收增加停止。紫外吸收增加的中點(diǎn)值溫度為熱變性溫度（Tm）。若真菌DNA中G+C堿基對(duì)含量多，Tm值就高?？芍苯臃从矴+C堿基對(duì)的絕對(duì)含量。計(jì)算公式為：G+Cmol％=(Tm-53.9)×2.44第30頁(yè)，共36頁(yè)，2023年，2月20日，星期一(二)真菌核型的脈沖電泳分析

脈沖凝膠電泳技術(shù)(PFGE)解決了真菌大分子DNA的分離技術(shù)難題。第31頁(yè)，共36頁(yè)，2023年，2月20日，星期一原理：PFGE有兩個(gè)方向的電場(chǎng)在設(shè)定的脈沖時(shí)間里交替變換，使大分子DNA在移動(dòng)中不斷改變自己的形狀及遷移方向，從而繞過(guò)細(xì)小的凝膠孔隙而得以分離。較大的DNA分子泳動(dòng)慢些，較小的快些，有許多因素影響電泳帶型，分離真菌等大分子量的DNA宜用較低電壓和較長(zhǎng)脈沖時(shí)間。第32頁(yè)，共36頁(yè)，2023年，2月20日，星期一用PFGE分析真菌核型，可直接比較其遺傳背景,從電泳核型差異中進(jìn)行分類鑒定,又能取得基因結(jié)構(gòu)的基本數(shù)據(jù)，構(gòu)建出大尺度物理圖譜。第33頁(yè)，共36頁(yè)，2023年，2月20日，星期一(三)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性

DNA(RAPD)分析RAPD分析是一種利用隨機(jī)合成的單個(gè)寡核苷酸引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增靶細(xì)胞DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳，分析DNA片段大小和數(shù)量的多態(tài)性，從而比較靶基因差異的一種技術(shù)。由于病原性真菌基因組龐大，RAPD分析適用于真菌的鑒定與分類。第34頁(yè)，共36頁(yè)，2023年，2月20日，星期一六、真菌毒素的檢測(cè)

真菌產(chǎn)生有毒的代謝產(chǎn)物，可引起急慢性真菌中毒癥，引起消化道中毒癥狀，而且可進(jìn)入人體內(nèi)引起病變，如引起肝臟損傷的黃曲霉毒素、雜色曲霉毒素；引起腎臟損害的桔青霉素；引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害的黃綠青霉素等。甚至有的毒素具有致癌性，