蛋白質等電點的測定

主要內容(1)了解蛋白質的兩性解離性質。(2)學習測定蛋白質等電點的方法。蛋白質的解離性質蛋白質是兩性電解質。在蛋白質溶液中存在下列平衡：最常用的方法是：①測其溶解度最低時的溶液pH值。②等電聚焦電泳測其凈電荷為零時的PH③濁度、分光光度法④基于蛋白質與離子交換的作用一、測定溶解度最低時的溶液PH實驗原理：借觀察在不同pH溶液中的溶解度以測定酪蛋白的等電點。用醋酸與酷酸鈉(醋酸鈉混合在酪蛋白溶液中)配制成各種不同pH值的緩沖液。向諸緩沖溶液中加入酪蛋白后，沉淀出現(xiàn)最多的緩沖液的pH值即為酪蛋白的等電點。器材：水浴鍋、溫度計、200毫升錐形瓶、100毫升容量瓶、吸管、試管、試管架、乳缽試劑：(1)0.4％酪蛋白醋酸鈉溶液

(2)1.00摩爾／升醋酸溶液

(3)0.10摩爾／升醋酸溶液

(4)0.01摩爾／升醋酸溶液

實驗器材與試劑：實驗步驟：(1)取同樣規(guī)格的試營4支，按下表顛序分別精確地加入各試劑，然后混勻。試管號

蒸餾水（ml）0.01M醋酸（ml）0.1M醋酸（ml）1M醋酸（ml）18.40.6——28.7—0.3—38.0—1.0—47.4——1.6二、等電聚焦電泳原理：1）有一類兩性電解質：它具有依次遞變而又相差不大的等電點，在電場下形成遞變而又連續(xù)的pH梯度，故在電泳介質中加入這種物質則能造成介質pH由酸到堿逐步變化。2)各種蛋白質pI不同3）兩性電解質載體在電場作用下，按各自pI形成從陽極到陰極逐漸增加的連續(xù)而穩(wěn)定的pH梯度以聚丙烯酰胺凝膠為電泳支持介質，并在凝膠中加入兩性電解質載體，在電場作用下，蛋白質在此pH梯度的凝膠中泳動，當遷移至pH值等于pI處時，就不再泳動，而被濃縮成狹窄的區(qū)帶。圖聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖

(A為正面,B為剖面)四、操作方法1.凝膠柱的制備（1）玻璃管的一端插在橡皮帽中（2）配膠表10mL7.5%凝膠的配制試劑名稱 體積(mL) 凝膠貯液 2.5 兩性電解質載體 0.5 蒸餾水 6.7510%過硫酸銨 0.0510%TEMED 0.1 蛋白質混合樣品 0.1 混勻后置真空干燥器中抽氣10min

（3）將配好的凝膠溶液用細長頭滴管加到預先準備好的玻管中，至離上端1cm處，再用注射器緩緩加水3-5mm高。（4）待凝膠聚合2.電泳

將裝有膠的玻管固定到電泳槽上槽的洞中（安裝時要保證凝膠管垂直且橡膠塞孔密封不漏）在上槽中裝入0.1mol/L氫氧化鈉溶液，在下槽中加入0.1mol/L磷酸緩沖液。連接到電泳儀，接通電源，調電壓至160V，聚焦過夜，至電流降為0，則可關閉電源。5.蛋白質條帶聚焦位置的計算求出蛋白質聚焦部位距凝膠條正極端的實際長度為：蛋白區(qū)帶中心距凝膠條正極端的距離

固定染色前凝膠條長度固定染色后凝膠條長度

三、濁度、分光光度法

溶液的pH值與蛋白質等電點相同時，靜電荷為0，當溶液pH值大于蛋白質等電