第二章基因工程基本技術(shù)原理DNA序列分析第1頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期一目的與要求掌握DNA測(cè)序的一般原理和方法，通過(guò)學(xué)習(xí)，分析DNA策序與蛋白質(zhì)策序的區(qū)別。重點(diǎn)：

Sanger雙脫氧鏈終止法策序原理和方法難點(diǎn)：如何根據(jù)凝膠電泳直接讀出DNA序列學(xué)時(shí)：2學(xué)時(shí)學(xué)習(xí)方法：課堂講授與討論相結(jié)合第2頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.5.1Sanger雙脫氧鏈終止法■

2.5.2Maxam－Gilbert化學(xué)修飾法■

2.5.3序列分析自動(dòng)化■2.5.4雜交測(cè)序■2.5.5DNA策序的商業(yè)運(yùn)作及存在問(wèn)題■2.5.6思考問(wèn)題■第3頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.5.1Sanger雙脫氧鏈終止法60年代末就已掌握了充分的理論知識(shí)，只是當(dāng)時(shí)在某些技術(shù)能力上和研究思路上，存在著弱點(diǎn)，阻礙了從理論轉(zhuǎn)變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)第一，如何分離寡核苷酸片段；另一方面，在研究思路上都沒(méi)有擺脫蛋白質(zhì)序列分析的束縛。返回DNA核酸序列分析歷程第4頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期一引物—延伸測(cè)序策略1968年華裔生物化學(xué)、生物學(xué)家吳瑞博士（Dr．RayWu）獨(dú)創(chuàng)性地設(shè)計(jì)出一種嶄新的引物延伸測(cè)序策略，并于1971年首次成功地測(cè)定了λ噬菌體兩個(gè)COS末端的完整序列；1977，F(xiàn).Sanger在該策略的基礎(chǔ)上，發(fā)展出了快速測(cè)定DNA序列的末端中止法；K.Mullis采納他的方法，完善了PCR擴(kuò)增DNA的方法；M．Smith發(fā)明了堿基定點(diǎn)突變技術(shù)。這三位科學(xué)家全都獲得了諾貝爾獎(jiǎng)。第5頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.5.1.1Sanger雙脫氧鏈終止法原理利用DNA聚合酶的兩種酶催反應(yīng)特性：1、利用單鏈DNA模板，合成DNA互補(bǔ)鏈；2、利用2’，3’雙脫氧核苷三磷酸作底物，參入到寡核酸鏈的末端，從而終止DNA鏈的生長(zhǎng)。也稱引物合成法，或酶催引物合成法。第6頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期一反應(yīng)：同時(shí)加入引物和模板、DNA聚合酶1、一種ddNTP、以及四種dNTP（有一種帶放射性標(biāo)記）。變性膠電泳分離反應(yīng)混合物。放射自顯影術(shù)，檢測(cè)單鏈DNA片段的放射性帶。結(jié)果判讀，從放射性X光底片上，直接讀出DNA的核酸順序。第7頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期一GTACGTTGACGCCddATPddTTPddGTPddCTPddCTPddATPddGTPddTTPAGTCAGGATCACC考考你第8頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期一酶、原料比例dNTP／ddNTP=100：1時(shí)，譜帶分離效果較佳，可讀出多于200個(gè)以上的核苷酸順序。降低dNTP對(duì)ddNTP濃度比，會(huì)產(chǎn)生逐漸加長(zhǎng)的片段，再配合使用長(zhǎng)膠和低濃度的聚丙烯酰氨凝膠，分辨能力可提高到能判讀出300個(gè)左右的核苷酸順序。第9頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.5.1.2Sanger雙脫氧-M13體系DNA序列分析法引物合成DNA序列測(cè)定法的特點(diǎn)及缺陷分析：這樣處理后，能策得高分子量DNA嗎？為了將這些降解的DNA片段，按其原來(lái)的順序“拼排”起來(lái)，至少還需要用一種或數(shù)種其它內(nèi)切限制酶，對(duì)同種DNA作酶切消化，并進(jìn)行電泳純化和序列分析。高分子量DNA分子消化降解成一組具一定長(zhǎng)度的限制片段，然后再用瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠作電泳分離純化，從膠中抽取DNA片段，供進(jìn)一步分析。費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、費(fèi)錢(qián)、DNA損傷嚴(yán)重第10頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期一克服缺點(diǎn)的一種途徑—DNA分子克隆將不同限制酶消化切割的DNA限制片段，隨機(jī)地克隆到載體分子上。選用天然的單鏈DNA噬菌體，例如M13作為載體，重組體噬菌體的DNA分子，可直接用作模板。引物：合成的特定的寡核苷酸，或者是從親本單鏈?zhǔn)删wDNA中分離出來(lái)的一種限制片段。其特點(diǎn)是能夠特異性地同載體分子上與克隆位點(diǎn)相連的單鏈DNA區(qū)段雜交。稱做“通用引物”。第11頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期一M13載體克隆DNA片段將DNA片段克隆在M13mp載體特定LacZ區(qū)段中重組體噬菌體在含有IPTG和Xgal的培養(yǎng)基平板上形成白色的噬菌斑;非重組體的噬菌體則形成藍(lán)色的噬菌斑。從白色的噬菌班中分離重組體噬菌體，并制備出單鏈DNA，就可以直接按雙脫氧鏈終止法進(jìn)行序列分析。第12頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期一這種隨機(jī)的方法，也需要通過(guò)順序的測(cè)定將派生的序列拼連起來(lái)，恢復(fù)成原來(lái)結(jié)構(gòu)形式的總DNA序列。第13頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期一使用M13載體系列的優(yōu)點(diǎn)所有的待測(cè)定的DNA片段，都可以共用一種引物。這樣，就避免了合成和分離各種不同引物的許多麻煩。應(yīng)用M13mp載體系列的雙脫氧鏈終止法，已經(jīng)成為一種最普遍采用的快速的DNA序列分析法。第14頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.5.1.3Sanger雙脫氧—pUC體系DNA序列分析法將待測(cè)DNA片段克隆到質(zhì)粒載體上，直接用閉合環(huán)形的雙鏈質(zhì)粒DNA按雙脫氧鏈終止法作DNA序列分析。這種方法特稱為利用雙鏈質(zhì)粒DNA模板的雙脫氧DNA序列分析法。由于通常使用的質(zhì)粒多是pUC載體系列，所以又稱之為Sanger雙脫氧鏈終止-pUC體系DNA序列分析法。第15頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期一Sanger雙脫氧—pUC體系DNA序列分析法基本步驟待測(cè)DNA與pBR322或pUC分子重組；轉(zhuǎn)化：轉(zhuǎn)化反應(yīng)物涂布在補(bǔ)加有Xgal-IPTG選擇性培養(yǎng)基平板上，經(jīng)37℃過(guò)夜培養(yǎng)；挑選白色菌落，制備質(zhì)粒NA。堿變性處理，與引物一起退火，然后按雙脫氧法作序列分析。優(yōu)點(diǎn)：無(wú)需將DNA克隆到M13載體上，更為簡(jiǎn)單快速，現(xiàn)已被許多研究工作者采用。返回目錄第16頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.5.2Maxam－Gilbert化學(xué)修飾法是1977年由美國(guó)哈佛大學(xué)的A．M．Maxam和W．Gilbert

發(fā)明的，所以又叫做Maxam－GilbertDNA序列分析法雖然說(shuō)對(duì)于大分子量的DNA片段的序列測(cè)定而言，化學(xué)修飾法并不如雙脫氧法方便有效，其發(fā)展速度也不及后者迅速，但是至今在相當(dāng)多的研究工作中仍被采用。第17頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.5.2.1Maxam－Gilbert化學(xué)修飾法的原理化學(xué)試劑處理末端標(biāo)記DNA片段，堿基的特異性切割產(chǎn)生的DNA片段混合物,電泳分離顯影后顯現(xiàn)譜帶，直接讀出待測(cè)DNA片段的核苷酸順序。第18頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期一出發(fā)材料：局部消化的DNA分子群體中純化出特定的末端帶有放射性標(biāo)記的DNA片段(雙鏈或單鏈）關(guān)鍵：4種核苷酸堿基中，有1～2種發(fā)生特異性的化學(xué)切割僅應(yīng)，包括堿基的修飾、修飾的堿基從其糖環(huán)上轉(zhuǎn)移出去以及在失去堿基的部位發(fā)生DNA鏈的斷裂三個(gè)主要內(nèi)容。第19頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期一堿基特異的化學(xué)切割反應(yīng)——肼（NH2·NH2）肼能夠從C4或C6位置作用于T和C，并用C4-C5-C6環(huán)化形成一種新環(huán);進(jìn)一步作用釋放出吡唑琳酮環(huán)，留下的N1－C2－N3片段則仍連在糖環(huán)上。在具有六氫吡啶的條件下，通過(guò)β-消除反應(yīng)，2個(gè)磷酸分子從糖片段上釋放出來(lái)，從而導(dǎo)致DNA鏈斷裂。反應(yīng)體系中加入lmol/L濃度的鹽，肼同T的反應(yīng)速率便會(huì)逐漸下降，以確保發(fā)生C特異的化學(xué)切割反應(yīng)。根據(jù)這一特點(diǎn)區(qū)別C和C+T之間的降解產(chǎn)物。第20頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期一堿基特異的化學(xué)切割反應(yīng)——硫酸二甲酯［（CH3O）2SO2］在硫酸二甲酯的作用下，堿基環(huán)中的氮原子發(fā)生甲基化反應(yīng)（G

N7和A

N3）。中性PH：甲基化導(dǎo)致配糖鍵水解，留下失去堿基的糖一磷酸骨架上的鍵。這種鍵十分微弱，易于使糖片段兩翼的磷酸脫落，造成DNA斷裂;堿性pH：采用六氫吡啶同DNA甲基化反應(yīng)，而這種反應(yīng)對(duì)甲基化的G是特異的。因此，DNA鏈的斷裂只在G發(fā)生。第21頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.5.2.2化學(xué)修飾法測(cè)序圖解第22頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期一CT+CG+AATTATCAGGATGGCGACTTCGAG+AT+CC試試看你作對(duì)了嗎？第23頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.5.2.3Maxam－Gilbert化學(xué)修飾法優(yōu)點(diǎn)不需要體外酶催合成反應(yīng)單雙鏈都可以需要末端標(biāo)記兩端采用不同的標(biāo)記，測(cè)序可從兩端進(jìn)行第24頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.5.3