講課內(nèi)容

IEFE定義

1

IEFE的特點(diǎn)

2

IEFE的基本原理3

IEFE的應(yīng)用4

血紅蛋白的等電聚焦電泳（實(shí)驗(yàn)）

5上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是1頁\一共有43頁\編輯于星期一一、IEFE定義

IEFE一種利用具有pH梯度的支持介質(zhì)分離等電點(diǎn)（isoelectricpoint，pI)不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。

Isoelectricfocusing(IEF),isatechniqueforseparatingdifferentmoleculesbytheirelectricchargedifferences.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是2頁\一共有43頁\編輯于星期一

等電聚焦(Isoelectricfocusing,IEF)就是在電泳介質(zhì)中放入載體兩性電解質(zhì)(Carrierampholyte)，當(dāng)通以直流電時(shí)，兩性電解質(zhì)即形成一個(gè)由陽極到陰極逐步增加的pH梯度，在此體系中，不同的蛋白質(zhì)即移動(dòng)到或聚焦于其相當(dāng)?shù)牡入婞c(diǎn)位置上，也就是說被聚焦于一個(gè)狹的區(qū)帶中，電泳技術(shù)中的等電點(diǎn)聚焦也稱為聚焦電泳。

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是3頁\一共有43頁\編輯于星期一講課內(nèi)容

IEFE定義

1

IEFE的特點(diǎn)

2

IEFE的基本原理3

IEFE的應(yīng)用4

血紅蛋白的等電聚焦電泳（實(shí)驗(yàn)）

5上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是4頁\一共有43頁\編輯于星期一二、IEFE的特點(diǎn)

（一）優(yōu)點(diǎn)HighResolutionHighSensitivity

GoodReproduction上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是5頁\一共有43頁\編輯于星期一（二）缺點(diǎn)1.要求用無鹽溶液，而在無鹽溶液中蛋白質(zhì)可能發(fā)生沉淀。2.樣品中的成分必須停留在其pI，不適用在pI不溶或發(fā)生變性的蛋白質(zhì)。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是6頁\一共有43頁\編輯于星期一分辨率(resolution)較不連續(xù)PAGE更高，特別適合于分離分子量(molecuarweight,MW)相同而電荷(electriccharge)不同的生物大分子。

QM=——6r上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是7頁\一共有43頁\編輯于星期一講課內(nèi)容

IEFE定義

1

IEFE的特點(diǎn)

2

IEFE的基本原理3

IEFE的應(yīng)用4

血紅蛋白的等電聚焦電泳（實(shí)驗(yàn)）

5上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是8頁\一共有43頁\編輯于星期一三、IEFE的基本原理上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是9頁\一共有43頁\編輯于星期一蛋白質(zhì)分子在不同pH下的解離狀態(tài)

NH3+NH3+NH2PPPCOOHCOO-COO-

pH＜pIpH＝pIpH＞pI

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是10頁\一共有43頁\編輯于星期一

在電泳介質(zhì)中放入載體兩性電解質(zhì)(carrierampholytes)

，當(dāng)通入直流電時(shí)，兩性電解質(zhì)形成一個(gè)由正極(anode)到負(fù)極(cathode)逐漸增加的pH梯度，正極附近是低pH區(qū)，負(fù)極附近是高pH區(qū)。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是11頁\一共有43頁\編輯于星期一蛋白質(zhì)分子的電聚焦過程

+pI1

pI2

pH=pIpI3

pIn-

abc

蛋白質(zhì)分子在負(fù)極端蛋白質(zhì)分子在正極端蛋白質(zhì)樣品中各組分聚焦成區(qū)帶

—+上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是12頁\一共有43頁\編輯于星期一

在這個(gè)從正極到負(fù)極pH逐漸增加的直流電場中，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)進(jìn)入這個(gè)環(huán)境，不同的蛋白質(zhì)帶上不同性質(zhì)和數(shù)量的電荷，向著一定方向移動(dòng)，遷移到與其相同的等電點(diǎn)位置上停留下來，即被聚焦于一個(gè)狹的區(qū)帶中，得以分離。TheproteinsbecomefocusedintosharpstationarybandswitheachproteinpositionedatapointinthepHgradientcorrespondingtoitspI.

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是13頁\一共有43頁\編輯于星期一上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是14頁\一共有43頁\編輯于星期一進(jìn)行IEFE必須具備3個(gè)條件：①有一個(gè)在電泳條件下基本穩(wěn)定、重復(fù)性良好的pH梯度②有一個(gè)抗對流的電泳材料，使已經(jīng)分離的樣品不再重新混合③電泳后有適當(dāng)?shù)姆椒▉龛b定分離的區(qū)帶上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是15頁\一共有43頁\編輯于星期一（一）pH梯度的建立

用多種兩性電解質(zhì)(ampholytes)混合物建立穩(wěn)定良好的pH梯度上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是16頁\一共有43頁\編輯于星期一1.理想的載體兩性電解質(zhì)（Carrierampholytes）應(yīng)具備的特征：

①分子量要小，以便與被分離大分子物質(zhì)分離；②化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定；③各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好的緩沖能力；④在pI處具有足夠的電導(dǎo)，導(dǎo)電性均勻；⑤兩性電解質(zhì)載體的數(shù)目要足夠多；⑥可溶性好；⑦對280nm的紫外光沒有或僅有很低的吸光度，不干擾樣品的測定。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是17頁\一共有43頁\編輯于星期一2.載體兩性電解質(zhì)的合成

本質(zhì)：一系列脂肪族(aliphaticampholytes)多氨基多羧酸同系物和異構(gòu)體，具有很多既不相同又十分接近相互連接的pI值。pH范圍：pH3~10丙烯酸+多乙烯多胺

Ampholine（LKB）加成反應(yīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是18頁\一共有43頁\編輯于星期一上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是19頁\一共有43頁\編輯于星期一3.pH梯度的形成

載體兩性電解質(zhì)(Carrierampholytes)是一系列不同分子的兩性電解質(zhì)的混合物,在通電后，它們各自遷移到適當(dāng)位置形成一個(gè)連續(xù)的pH梯度(pHgradient)。

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是20頁\一共有43頁\編輯于星期一

㈠沒通電時(shí)的變化所有的載體兩性電解質(zhì)(Carrierampholytes)分子都荷電，只是溶液中荷正電和荷負(fù)電的基團(tuán)數(shù)目相等，凈電荷(netcharge)為零。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是21頁\一共有43頁\編輯于星期一㈡引入電場時(shí)的變化載體兩性電解質(zhì)(carrierampholytes)分子將向陰極(cathode)或陽極(anode)遷移，帶有最低等電點(diǎn)的分子（荷最多的負(fù)電）將最快地向陽極遷移。當(dāng)它達(dá)到凈電荷是零的位置時(shí)才停止。其次一些低pI的載體兩性電解質(zhì)分子（荷其次多的負(fù)電）也將向陽極移動(dòng)，直到它的凈電荷被減少到零才停止。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是22頁\一共有43頁\編輯于星期一㈢電泳結(jié)束后的變化

所有的載體兩性電解質(zhì)(carrierampholytes)分子以增加pI級數(shù)的辦法將分別在陽、陰極之間到達(dá)它們自己的位置而給出一個(gè)pI梯度。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是23頁\一共有43頁\編輯于星期一上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是24頁\一共有43頁\編輯于星期一電解槽中，通電后，正負(fù)兩極都會(huì)發(fā)生電極反應(yīng)：正極端反應(yīng)：6H2O→O2+4H3O++4e-負(fù)極端反應(yīng)：4H2O+4e-→2H2+4OH-在負(fù)極引起pH值的升高，在正極pH下降，另外在電極槽的正極端放的是酸性溶液，負(fù)極端放的是堿性溶液造成了在電極附近pH的急劇變化上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是25頁\一共有43頁\編輯于星期一

由于載體兩性電解質(zhì)(carrierampholytes)是一系列不同分子的兩性電解質(zhì)的混合物所組成的，設(shè)其中某一成分為A，它的pI=pH’，當(dāng)環(huán)境中的pH>pH’時(shí)，它帶負(fù)電荷，朝正極移動(dòng)。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是26頁\一共有43頁\編輯于星期一當(dāng)環(huán)境pH<pH’時(shí)，它帶正電荷，朝負(fù)極移動(dòng)，直至移動(dòng)到它的等電點(diǎn)處，在那里聚集。由于兩性電解質(zhì)A在它的pI處具有一定的緩沖能力，因此在它附近形成一個(gè)pH穩(wěn)定區(qū)域。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是27頁\一共有43頁\編輯于星期一

同樣載體兩性電解質(zhì)(carrierampholytes)中各種兩性電解質(zhì)也會(huì)各自遷移到它們的等電點(diǎn)(isoelectricpoint,pI)處，由于它們的數(shù)量足夠多，各自的等電點(diǎn)相差很小，從而形成一個(gè)pH梯度。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是28頁\一共有43頁\編輯于星期一上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是29頁\一共有43頁\編輯于星期一上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是30頁\一共有43頁\編輯于星期一（二）支持介質(zhì)(medium)的選擇

作用：防止擴(kuò)散抗對流liquidmedium：蔗糖、Ficollgelmedium：agarose、sephadex、PAG上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是31頁\一共有43頁\編輯于星期一（三）聚焦后的檢測方法各種染色法掃描與定量其它檢測方法上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是32頁\一共有43頁\編輯于星期一講課內(nèi)容

IEFE定義

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IEFE的特點(diǎn)

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IEFE的基本原理3

IEFE的應(yīng)用4

血紅蛋白的等電聚焦電泳（實(shí)驗(yàn)）

5上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是33頁\一共有43頁\編輯于星期一四、IEFE的應(yīng)用

ApplicationsofIEF1.分析分離制備蛋白質(zhì)、多肽①區(qū)分人血清蛋白②測出異常免疫球蛋白③基因分型④csf中寡克隆區(qū)帶的檢測2.測定pI可鑒定蛋白質(zhì)、多肽3.雙相電泳中，IEF作為第一相上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是34頁\一共有43頁\編輯于星期一雙向電泳（two-dimensionalelectrophoresis,2-DE）上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是35頁\一共有43頁\編輯于星期一考馬斯亮藍(lán)銀染上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是36頁\一共有43頁\編輯于星期一講課內(nèi)容

IEFE定義

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IEFE的特點(diǎn)

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IEFE的基本原理3

IEFE的應(yīng)用4

血紅蛋白的等電聚焦電泳（實(shí)驗(yàn)）

5上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是37頁\一共有43頁\編輯于星期一實(shí)驗(yàn)血紅蛋白的等電聚焦電泳Hb具有四條多肽鏈

（α、β、γ、δ）

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是38頁\一共有43頁\編輯于星期一HbA正常成人血中主要的Hb成分。HbA2

正常成人Hb中的一個(gè)次要成分，當(dāng)

胎兒出生時(shí)，其濃度不到1%，以后

稍增多，在正常成人中其平均值自

2.2%至2.6%左右，最高范圍一般

不超過3.5%。

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)在是39頁\一共有43頁\編輯于星期一HbF1866年發(fā)現(xiàn)，是胎兒和初生兒的Hb的主要成分，足月的初生嬰兒血中大約有70-80%為HbF，其余為HbA。嬰兒出生后不久，HbF的濃度迅速減少，同時(shí)HbA相應(yīng)增多，絕大多數(shù)正常人于出