本文格式為Word版，下載可任意編輯——土壤微生物測(cè)定方法土壤微生物測(cè)定

土壤微生物活性表示土壤中整個(gè)微生物群落或其中的一些特別種群狀態(tài)，可以反映自然或農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的微小變化。土壤微生物活性的表征量有:微生物量、C/N、土壤呼吸強(qiáng)度和纖維呼吸強(qiáng)度、微生物區(qū)系、磷酸酶活性、酶活性等。

測(cè)定指標(biāo)：

1、土壤微生物量(MierobialBiomass，MB)

能代表參與調(diào)控土壤能量和養(yǎng)分循環(huán)以及有機(jī)物質(zhì)轉(zhuǎn)化相對(duì)應(yīng)微生物的數(shù)量，一般指土壤中體積小于5Χ103um3的生物總量。它與土壤有機(jī)質(zhì)含量密切相關(guān)。

目前，熏蒸法是使用最廣泛的一種測(cè)定土壤微生物量的方法閻，它是將待測(cè)土壤經(jīng)藥劑熏蒸后，土壤中微生物被殺死，被殺死的微生物體被新加人原土樣的微生物分解(礦化)而放出CO2，根據(jù)釋放出的CO2:的量和微生物體礦化率常數(shù)Kc可計(jì)算出該土樣微生物中的碳量。因此碳量的大小就反映了微生物量的大小。

此外，還有平板計(jì)(通過顯微鏡直接計(jì)數(shù))、成份分析法、底物誘導(dǎo)呼吸法、熏蒸培養(yǎng)法(測(cè)定油污染土壤中的微生物量—碳。受土壤水分狀況影響較大，不適用強(qiáng)酸性土壤及剛施用過大量有機(jī)肥的土壤等)、熏蒸提取法等，均可用來測(cè)定土壤微生物量。

熏蒸提取-容量分析法操作步驟：（1）土壤前處理和熏蒸（2）提取

將熏蒸土壤無損地轉(zhuǎn)移到200mL聚乙烯塑料瓶中，參與100mL0.5mol·L-1K2SO4（圖水比為1:4；w：v），振蕩30min（300rev·min-1），用中速定量濾紙過濾于125mL塑料瓶中。熏蒸開始的同時(shí)，另稱取等量的3份土壤于200mL聚乙烯塑料瓶中，直接參與100mlL0.5mol·L-1K2SO4提??；另作3個(gè)無土壤空白。提取液應(yīng)馬上分析。（3）測(cè)定

吸取10mL上述土壤提取液于150mL消化管（24mmх295mm）中，確鑿參與10mL0.018mol·L-1K2Cr2O7—12mol·L-1H2SO4溶液，參與2~3玻璃珠或瓷片，混勻后置于175±1℃磷酸浴中煮沸10min（放入消化管前，磷酸浴溫度應(yīng)調(diào)至179℃，放入后溫度恰好為175℃）。冷卻后無損地轉(zhuǎn)移至150mL三角瓶中，用去離子水洗滌消化管3~5次使溶液體積約為80mL，參與一滴鄰菲羅啉指示劑，用0.05mol·L-1硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，溶液顏色由橙黃色變?yōu)樗{(lán)色，再變?yōu)榧t棕色，即為滴定終點(diǎn)。（4）結(jié)果計(jì)算

124?103M（V0-V）f-1

有機(jī)碳量（mg·C·kg）?

W式中M為FeSO4溶液濃度；V0、V分別為空白和樣品消耗的FeSO4溶液的體積（mL），f為稀釋倍數(shù)；W為烘干土質(zhì)量（g）；

土壤微生物生物量碳：Bc=Ec/kEC

式中Ec為熏蒸與未熏蒸土壤的差值；kEC為轉(zhuǎn)換系數(shù)，取值0.38

2、菌種測(cè)定

土壤微生物種類豐富，主要有細(xì)菌、真菌及放線菌等。各菌種在細(xì)胞代謝中起著特別的重要作用。

細(xì)菌用牛肉汁蛋白陳瓊脂培養(yǎng)基平板混菌法培養(yǎng)測(cè)定；真菌用馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基平板混菌法培養(yǎng)測(cè)定；放線菌用高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基平板混菌法或淀粉按培養(yǎng)基稀釋平板法培養(yǎng)測(cè)定。

3、土壤呼吸強(qiáng)度和纖維分解強(qiáng)度

土壤呼吸強(qiáng)度和纖維分解強(qiáng)度是土壤微生物活性的重要標(biāo)志，反映了土壤中微生物活性及對(duì)有機(jī)質(zhì)殘?bào)w分解的速度和強(qiáng)度。纖維素分解強(qiáng)度采用埋片法；呼吸強(qiáng)度采用堿吸收滴定法。土壤微生物活性用土壤呼吸CO2測(cè)定法（5g鮮土于310mL試劑瓶中，22℃24h測(cè)CO2釋放量(用exH23os紅外CO:分析儀測(cè)定)）。直接測(cè)定土壤呼吸的方法基本可分為靜態(tài)氣室法、動(dòng)態(tài)氣室法和微氣象法三種。

密閉靜置培養(yǎng)法原理：

CO2+KOHK2CO3+H2OK2CO3+KOHKHCO3+KCl+H2OKHCO3+HClKCl+H2CO3操作步驟：

稱取20g新鮮土（為了加強(qiáng)呼吸作用，土壤中可參與葡萄糖，6mg·g-1）于500mL的廣口瓶中，將土壤加水潤濕到最大持水量的70%，用50mL小燒杯，注入20mL0.1M的KOH溶液，然后密閉廣口瓶，于28℃恒溫培養(yǎng)24h。然后取出，以酚酞為指示劑，用0.1M的HCl溶液滴定。領(lǐng)取同樣容積的廣口瓶，同上處理，不加土壤作為對(duì)照。根據(jù)兩者之差，求出消耗用于吸收CO2的KOH量。4、酶活性測(cè)定

土壤酶大多數(shù)來自土壤微生物，在土壤中已發(fā)現(xiàn)50—60種酶，它們參與并催化土壤中發(fā)生的一系列繁雜的生物化學(xué)反應(yīng)。如水解酶和轉(zhuǎn)化酶對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)的形成和養(yǎng)分循環(huán)具有重要的作用。已有研究說明，土壤酶活性和土壤結(jié)構(gòu)參數(shù)有很好的相關(guān)性。土壤微生物酶主

要有脫氫酶、磷酸酶、精氨酸酶及芳基硫酸酯酶等。4.1脫氫酶活性的測(cè)定

通過測(cè)定呼吸鏈脫氫酶活性可表征微生物代謝活力大小。鄭志永等通過對(duì)氯化碘硝基四氮哇(INT)比色法反應(yīng)條件的研究，確定了呼吸鏈脫氫酶活性的測(cè)定方法。4.2過氧化氫酶活性的測(cè)定（本部做，需要冰箱）

土壤過氧化氫酶采用高錳酸鉀容量法，以20min后1g土壤消耗KMnO4(0.11~lmol·L-1)的量表示，或運(yùn)用注入土壤中的過氧化氫在反應(yīng)后剩余量的方法測(cè)定。

操作步驟：

稱取5g新鮮土壤樣品于100mL三角瓶中。參與甲苯0.5mL，搖勻，與0~4℃冰箱中放置半小時(shí)。取出，立刻參與25mL冰箱貯存的含3%H2O2的水溶液。充分搖勻后，再放冰箱中半小時(shí)。取出，迅速參與2NH2SO44mL，用0.1NKMnO4溶液滴定。根據(jù)對(duì)照和試樣消耗高錳酸鉀的差，求出相當(dāng)于分解的H2O2的量，酶活性以1g土壤、1h內(nèi)消耗KMnO4的量計(jì)算。

4．3尿酶活性的測(cè)定

尿酶采用鈉氏比色法，常用1g土，在37℃培養(yǎng)24h后釋放出的氨態(tài)氮的含量(mg)表示；操作步驟：

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

分別取0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5mL50ug/mL的氮標(biāo)準(zhǔn)溶液于25mL容量瓶中。用水稀釋至10mL，搖勻，參與1mL酒石酸鉀鈉，0.8mL鈉氏劑，搖勻。漸漸參與4mL1MNaOH溶液，稀釋至刻度，顯色10min后，測(cè)定吸光度值。

（2）稱取5g土壤，置于100mL三角瓶中。參與10mLpH6.7磷酸緩沖溶液及0.5mL甲苯，混合處理15min后，參與10mL10%尿素溶液（對(duì)照以水代替），置于37℃恒溫箱中，培養(yǎng)48h。

（3）培養(yǎng)終止后，取出，參與20mL1MKCl溶液，充分搖勻10min。將懸濁液用濾紙過濾，吸取經(jīng)過稀釋的濾液1mL，按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作，參與酒石酸鉀鈉，鈉氏劑等進(jìn)行顯色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出氨氮含量。計(jì)算土壤尿酶的活性。4.4蛋白酶活性的測(cè)定

蛋白酶活性用明膠在磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)中水解生成甘氨酸的方法測(cè)定；銅鹽比色法方法原理：

本法以精膠為基質(zhì)，酶解后所釋放出的氨基酸使其與銅鹽反應(yīng)形成藍(lán)色復(fù)合物。用比色法測(cè)定顏色深度。操作步驟：

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取0~20mL50ug/mL甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，用蒸餾水加之20mL，然后參與20mL新配制的銅—磷酸鹽溶液，顯色后于650nm處，測(cè)定吸光度。（2）測(cè)定操作

稱取5g土壤置于100mL三角瓶中。參與甲苯2mL，放置15