細(xì)胞凍存復(fù)蘇及腹水制備第1頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期二購(gòu)買(mǎi)抗原或提取抗原免疫小鼠檢測(cè)效價(jià)解凍NS1制備飼養(yǎng)細(xì)胞融合檢測(cè)抗體三次克隆化擴(kuò)大培養(yǎng)凍存細(xì)胞接種小鼠腹腔7-10天前注射液體石蠟抽取腹水腹水純化標(biāo)記單抗鑒定立項(xiàng)復(fù)蘇并培養(yǎng)項(xiàng)目組進(jìn)行評(píng)價(jià)一腹水制備組的主要工作第2頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期二我們主要制備的腹水有三類(lèi)：1，研發(fā)性：即小樣，要求注射兩只小鼠，至少5ml腹水。2，中樣：從小樣里面篩選出來(lái)的細(xì)胞株，一般要求5只。3，生產(chǎn)性：供應(yīng)生產(chǎn)用的腹水。腹水制備的原則：保質(zhì)保量！對(duì)我們的要求：必須要有高度的責(zé)任心。第3頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期二目前，大量生產(chǎn)單抗的方法主要有兩種：1，體外培養(yǎng)法，從上清中獲取單克隆抗體（1）懸浮培養(yǎng)法：和常規(guī)靜置培養(yǎng)相比，增加了細(xì)胞生長(zhǎng)空間，使單位體積內(nèi)細(xì)胞數(shù)量增多，從而增加抗體量。（2）固相培養(yǎng)法：?jiǎn)螌优囵B(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的結(jié)合，主要用于貼壁性較強(qiáng)的雜交瘤細(xì)胞，以小的固體顆粒作為細(xì)胞生長(zhǎng)的載體，細(xì)胞固定在載體表面生長(zhǎng)。體外培養(yǎng)法優(yōu)點(diǎn)：工藝簡(jiǎn)單，易于控制，目前上市的單抗多用此法。體外培養(yǎng)法缺點(diǎn)：抗體濃度低，一般含量為200～500μg左右。二，為什么要制備腹水？第4頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期二2.動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)法（1）實(shí)體瘤法：將對(duì)數(shù)期細(xì)胞按(1～3)×107個(gè)/ml接種于小鼠背部皮下，多點(diǎn)注射，待腫瘤達(dá)到一定大小后可采血獲得抗體，一般1～10mg/ml，缺點(diǎn)是采血量有限。（2）腹水制備法：腹水抗體的濃度達(dá)2～5mg/ml，一般可以抽取5ml左右腹水。該法優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，是一般用途單克隆抗體制備的首選方法，一般用于生產(chǎn)科研或診斷用的單克隆抗體。第5頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期二三，腹水產(chǎn)生的原因：1，雜交瘤細(xì)胞注射到小鼠腹腔后，大量腫瘤細(xì)胞在腹腔中生長(zhǎng)，分泌很多刺激性的因子，膠體滲透壓升高，導(dǎo)致腹水產(chǎn)生。2，雜交瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)對(duì)腹膜是個(gè)刺激，引起炎癥反應(yīng)導(dǎo)致腹膜上的毛細(xì)血管通透性增加，體液漏出，形成腹水

。第6頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期二四，液體石蠟的作用：1，免疫抑制劑，注射石蠟油（降植烷和不完全福氏佐劑）可以降低小鼠的免疫力，從而降低小鼠對(duì)接種的雜交瘤細(xì)胞的排斥反應(yīng)；2，石蠟（降植烷、不完全福氏佐劑）可以強(qiáng)烈刺激小鼠產(chǎn)生白細(xì)胞介素6（IL－6），IL－6是最重要、最主要的漿細(xì)胞（成熟的抗體分泌細(xì)胞）生長(zhǎng)因子，因此注射上述幾種物質(zhì)都可以通過(guò)刺激IL－6的產(chǎn)生，為接種的雜交瘤細(xì)胞提供較好的生存環(huán)境并促進(jìn)腹水的形成。

第7頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期二注射液體石蠟注意事項(xiàng)：1，拿小鼠姿勢(shì)正確，不要被咬傷。2，不要將針頭對(duì)著其他人。3，石蠟不能注射到皮下。4，注射石蠟時(shí)要注意石蠟的量（0.5ml）。5，發(fā)現(xiàn)不同性別小鼠時(shí)要將其分開(kāi)。6，注射完畢后要及時(shí)做好標(biāo)記。7，發(fā)現(xiàn)缺水少食時(shí)應(yīng)及時(shí)提醒添加。第8頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第二章，細(xì)胞的復(fù)蘇一，確定復(fù)蘇的細(xì)胞數(shù)二，制備適量的飼養(yǎng)細(xì)胞三，細(xì)胞的復(fù)蘇四，細(xì)胞復(fù)蘇的注意事項(xiàng)第9頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期二一，首先確定復(fù)蘇的細(xì)胞數(shù)1，比較緊急的項(xiàng)目對(duì)于研發(fā)性腹水一般要先和領(lǐng)導(dǎo)溝通確定哪些項(xiàng)目緊急，緊急的項(xiàng)目要隨時(shí)準(zhǔn)備復(fù)蘇。例如，目前緊急的有腫瘤系列細(xì)胞如CA153CR，CA724，colo205等。中樣腹水一般由領(lǐng)導(dǎo)直接下單子。2，根據(jù)實(shí)際情況自行安排一般按項(xiàng)目進(jìn)行復(fù)蘇，先緊同一個(gè)項(xiàng)目復(fù)蘇，切忌不要同時(shí)復(fù)蘇多個(gè)項(xiàng)目，這樣容易弄亂，并且交接時(shí)比較麻煩。第10頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期二二，制備適量的飼養(yǎng)細(xì)胞

確定完復(fù)蘇的細(xì)胞數(shù)量后就要準(zhǔn)備飼養(yǎng)細(xì)胞，一般一只小鼠的飼養(yǎng)細(xì)胞可以配置100mlDMEM培養(yǎng)基，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量的多少確定小鼠的數(shù)量，加樣備用。目前，一般情況24孔板1.5ml/孔，6孔板5ml/孔，大平皿30ml/板。注意事項(xiàng)：1，培養(yǎng)液和血清必須用新的，并記錄批號(hào)。2，制備過(guò)程嚴(yán)格無(wú)菌操作。3，第二天確定沒(méi)有污染后方可使用。第11頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期二三，細(xì)胞的復(fù)蘇1、將新鮮培養(yǎng)基置于37℃水槽中回溫，回溫后以75%酒精消毒，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。2、取50ml離心管，加入細(xì)胞凍存前所用基礎(chǔ)培養(yǎng)液5ml。3、根據(jù)復(fù)蘇申請(qǐng)單，由細(xì)胞管理員將細(xì)胞從液氮中取出，細(xì)胞使用人核對(duì)后，立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1min內(nèi)全部融化，以75%酒精消毒?，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。4、取出復(fù)蘇細(xì)胞懸浮液，緩緩加入已準(zhǔn)備的培養(yǎng)液中，混合均勻后，1500rpm離心5min。5、將離心管取出，棄去上清，用含血清培養(yǎng)基重懸后,加入6孔板或小號(hào)平皿中，觀察細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)狀況并記錄，37℃5%CO2培養(yǎng)。6、次日觀察有無(wú)污染。第12頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期二以下原因可能導(dǎo)致復(fù)蘇失敗：1，飼養(yǎng)細(xì)胞有污染卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。2，細(xì)胞在水浴鍋中時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或水進(jìn)入凍存管。3，操作過(guò)程存在污染。4，沒(méi)有更換槍頭，導(dǎo)致交叉污染。5，沒(méi)有記錄細(xì)胞的名稱(chēng)及其編號(hào)或者有重號(hào)現(xiàn)象。第13頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期二四，細(xì)胞復(fù)蘇的注意事項(xiàng)：1，所用器材經(jīng)過(guò)高壓處理，培養(yǎng)基和血清是新的。2，整個(gè)過(guò)程保證無(wú)菌操作。3，復(fù)蘇的關(guān)鍵是速融，一般在1min內(nèi)。4，及時(shí)更換槍頭，避免交叉污染。5，及時(shí)記錄細(xì)胞的名稱(chēng)及其編號(hào)批號(hào)，切忌弄混。6，復(fù)蘇完畢后重新核實(shí)復(fù)蘇的細(xì)胞名稱(chēng)和編號(hào)批號(hào)。7，填寫(xiě)復(fù)蘇記錄表。第14頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)機(jī)的選擇：平時(shí)一般選取在周五，原因：一般情況周五復(fù)蘇后下周一會(huì)有一半細(xì)胞可以注射小鼠，一般三四天可以全部注射完，7天后的周一開(kāi)始抽取，這樣周末就不會(huì)太忙。假期前要合理規(guī)劃復(fù)蘇時(shí)間，不要留太多，一個(gè)制備周期大概就是20天左右。第15頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第三章，細(xì)胞的培養(yǎng)和消化一，細(xì)胞培養(yǎng)的概念及生長(zhǎng)方式二，細(xì)胞的常見(jiàn)污染及處理三，細(xì)胞的消化四，細(xì)胞培養(yǎng)的注意事項(xiàng)第16頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期二一，細(xì)胞培養(yǎng)的概念：把來(lái)自機(jī)體的組織經(jīng)分散成為單個(gè)細(xì)胞，放在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無(wú)菌、適當(dāng)溫度和一定的營(yíng)養(yǎng)條件下，使之不斷生長(zhǎng)、繁殖或傳代，借以觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖、衰老等生命現(xiàn)象。細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)物可以是單個(gè)細(xì)胞（稱(chēng)為克隆培養(yǎng)），也可以是細(xì)胞群（稱(chēng)為群體培養(yǎng)）。見(jiàn)下圖：第17頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期二2023/4/16概述群體培養(yǎng)克隆培養(yǎng)第18頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞的生長(zhǎng)方式：（1）貼附生長(zhǎng)：必須貼附于支持物表面才能生長(zhǎng)。見(jiàn)于各種實(shí)體瘤細(xì)胞。（2）懸浮生長(zhǎng)：于懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)，不需要貼附于支持物表面。見(jiàn)于各種造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞。第19頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期二一次培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)周期第20頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期二2023/4/16二，細(xì)胞培養(yǎng)的污染細(xì)菌污染小鼠胃癌細(xì)胞的球菌感染

培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，PH改變。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。第21頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期二2023/4/16二，細(xì)胞培養(yǎng)的污染真菌污染

培養(yǎng)細(xì)胞受真菌污染后，可見(jiàn)培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點(diǎn)，有的散在生長(zhǎng)，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見(jiàn)絲狀、管狀或樹(shù)枝狀的菌絲縱橫交錯(cuò)在細(xì)胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。絲狀菌污染的污染第22頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期二二，細(xì)胞培養(yǎng)的污染支原體污染培養(yǎng)細(xì)胞受支原體污染后，部分敏感細(xì)胞可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖變慢，部分細(xì)胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細(xì)胞污染后無(wú)明顯變化，或略有變化，若不及時(shí)處理，還會(huì)產(chǎn)生交叉污染。支原體污染檢測(cè)陽(yáng)性陰性第23頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期二2023/4/16二，細(xì)胞培養(yǎng)的污染病毒污染盡管病毒污染的細(xì)胞不影響原代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗是不安全的。因此，潛在病毒是細(xì)胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。冠狀病毒掃描電鏡圖第24頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期二2023/4/16二，細(xì)胞污染的處理原則細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)污染，多數(shù)較難處理。如果污染細(xì)胞價(jià)值不大，宜棄之，并且用NaOH處理；在尋找原因后徹底消毒操作室，復(fù)蘇或重新購(gòu)置細(xì)胞，再培養(yǎng)。小鼠腹腔回收法：小鼠腹腔是一個(gè)天然的過(guò)濾系統(tǒng)，將被污染的雜交瘤細(xì)胞注射進(jìn)去后，腹腔會(huì)將污染物自動(dòng)清除（包括支原體），等到長(zhǎng)出腹水無(wú)菌操作回收細(xì)胞即可。

第25頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期二三，貼壁細(xì)胞的消化：1，吸去培養(yǎng)液，用無(wú)菌的PBS、Hanks液或無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞一次，以去除殘余的血清。2，加入少量胰酶細(xì)胞消化液，略蓋過(guò)細(xì)胞即可，室溫放置30秒至2分鐘。3，顯微鏡下觀察，細(xì)胞明顯收縮，并且肉眼觀察培養(yǎng)器皿底部發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生明顯的變化；或者用槍吹打細(xì)胞發(fā)現(xiàn)細(xì)胞剛好可以被吹打下來(lái)，此時(shí)吸除胰酶細(xì)胞消化液。加入含血清的培養(yǎng)液終止胰酶（競(jìng)爭(zhēng)抑制），吹打下細(xì)胞，即可直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

4，如果發(fā)現(xiàn)消化不足，則加入胰酶細(xì)胞消化液重新消化。

5，如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，未及吹打細(xì)胞，細(xì)胞已經(jīng)有部分直接從培養(yǎng)器皿底部脫落，直接用胰酶細(xì)胞培養(yǎng)液把細(xì)胞全部吹打下來(lái)，1000-2000r離心1min，盡量去除胰酶細(xì)胞消化液后，加入含血清的完全培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，即可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

第26頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期二三，貼壁細(xì)胞的消化：1，吸去培養(yǎng)液，用無(wú)菌的PBS、Hanks液或無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞一次，以去除殘余的血清。2，加入少量胰酶細(xì)胞消化液，略蓋過(guò)細(xì)胞即可，室溫放置30秒至2分鐘。3，顯微鏡下觀察，細(xì)胞明顯收縮，并且肉眼觀察培養(yǎng)器皿底部發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生明顯的變化；或者用槍吹打細(xì)胞發(fā)現(xiàn)細(xì)胞剛好可以被吹打下來(lái)，此時(shí)吸除胰酶細(xì)胞消化液。加入含血清的培養(yǎng)液終止胰酶（競(jìng)爭(zhēng)抑制），吹打下細(xì)胞，即可直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

4，如果發(fā)現(xiàn)消化不足，則加入胰酶細(xì)胞消化液重新消化。

5，如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，未及吹打細(xì)胞，細(xì)胞已經(jīng)有部分直接從培養(yǎng)器皿底部脫落，直接用胰酶細(xì)胞培養(yǎng)液把細(xì)胞全部吹打下來(lái)，1000-2000r離心1min，盡量去除胰酶細(xì)胞消化液后，加入含血清的完全培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，即可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

第27頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期二四，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的注意事項(xiàng)：1，要定期觀察細(xì)胞的狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)問(wèn)題及時(shí)處理，切忌將細(xì)胞棄之不顧。2，不能頻繁將細(xì)胞拿進(jìn)拿出，會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。3，不能頻繁更換培養(yǎng)基，細(xì)胞生長(zhǎng)有一個(gè)適應(yīng)過(guò)程。4，必須更換培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌操作，避免交叉污染。如液體變黃，死細(xì)胞過(guò)多等原因可考慮換液。5，培養(yǎng)基應(yīng)該做到專(zhuān)人專(zhuān)用。6，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞污染后需要及時(shí)處理，避免傳染。第28頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第四章，腹水的制備一，細(xì)胞的準(zhǔn)備二，小鼠的選擇三，細(xì)胞的注射四，腹水的抽取第29頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期二一，細(xì)胞的準(zhǔn)備：細(xì)胞復(fù)蘇后要密切關(guān)注其生長(zhǎng)狀態(tài)，一般要求注射數(shù)量為（5-10）×105個(gè)/只，研發(fā)性細(xì)胞要求超過(guò)3/4孔注射兩只。注射的細(xì)胞要求狀態(tài)良好，處于對(duì)數(shù)期，細(xì)胞又圓又亮。經(jīng)驗(yàn)：一般情況下一批細(xì)胞復(fù)蘇后兩天就可以注射總數(shù)的一半，三天后注射剩下的一半，7天內(nèi)基本可以全部注射。如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞聚堆現(xiàn)象要輕輕吹開(kāi)，狀態(tài)不好的細(xì)胞要換液并且加飼養(yǎng)細(xì)胞，但操作要輕柔。第30頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期二吹打細(xì)胞時(shí)注意事項(xiàng)：1，動(dòng)作輕柔，不能濺到其他孔中2，細(xì)胞時(shí)被吹掉的而不是被劃掉的，不能留死角3，及時(shí)更換槍頭，避免交叉污染4，及時(shí)在離心管上寫(xiě)上細(xì)胞信息。生理鹽水洗細(xì)胞時(shí)注意事項(xiàng)：1，蓋子要對(duì)號(hào)入座，避免交叉污染。2，加生理鹽水時(shí)應(yīng)懸空，不能回濺到槍頭上污染整瓶生理鹽水第31頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期二二，小鼠的選擇小鼠的選擇很研發(fā)重要，不僅關(guān)系到腹水的數(shù)量還關(guān)系到質(zhì)量，研發(fā)性和中樣細(xì)胞必須挑選狀態(tài)好的小鼠，小鼠健康標(biāo)準(zhǔn)：1,食欲旺盛；2,眼睛有神，反應(yīng)敏捷；3,體毛光滑，肌肉豐滿，活動(dòng)有力；4,身無(wú)傷痕，尾不彎曲，天然孔腔無(wú)分泌物，無(wú)畸形；5,糞便黑色呈麥粒狀；6,小鼠的尾、趾有無(wú)潰爛；7,檢查眼、耳、鼻、肛門(mén)有無(wú)分泌物和異常增殖物;8,肚子不癟進(jìn)去第32頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期二三，細(xì)胞的注射

一般情況研發(fā)性細(xì)胞每只注射0.4ml，中樣和大樣注射0.2ml。注射完畢后要及時(shí)把項(xiàng)目名稱(chēng)和編號(hào)及注射時(shí)間記錄到籠子上面。注意事項(xiàng)：1，細(xì)胞數(shù)量和狀態(tài)2，細(xì)胞不能注射到皮下3，籠子上細(xì)胞信息要完整4，填寫(xiě)注射記錄第33頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期二四，腹水的抽取注射完細(xì)胞一周左右時(shí)間會(huì)長(zhǎng)腹水，一般第六天就需要觀察，防止脹死。小鼠腹腔明顯脹大或者發(fā)黑就必須抽取，但首次抽取應(yīng)該輕柔，不能抽取過(guò)度。個(gè)人操作對(duì)腹水產(chǎn)量有影響，因此盡可能熟練掌握，抽的又快又多。第34頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期二抽取腹水時(shí)的注意事項(xiàng):1，抽取時(shí)機(jī)的把握，一周左右肚子明顯脹大或者發(fā)黑。2，抽取時(shí)應(yīng)該輕柔，特別是第一次。3，抽取部位不能太靠近大腿，否則傷口難以愈合。4，研發(fā)性抽取時(shí)不要弄亂注射器，避免交叉污染，及時(shí)記錄。5，每次抽取前后吹打干凈針頭，防止堵塞。6，發(fā)現(xiàn)針頭變鈍要及時(shí)更換。7，倒腹水時(shí)看清楚，不能倒亂，不能倒進(jìn)去沉淀。8，抽取大樣最好更換手套。第35頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第五章，細(xì)胞的凍存一，凍存原因二，凍存要求三，凍存失敗原因四，凍存時(shí)注意事項(xiàng)

第36頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，