靜美的細(xì)胞凋亡—細(xì)胞凋亡的特征與檢測細(xì)胞凋亡（apoptosis）死如秋葉之靜美“凋亡”在希臘語里的原意是樹葉的凋落細(xì)胞壞死極端的物理、化學(xué)因素或嚴(yán)重的病理性刺激導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性喪失、細(xì)胞破損、細(xì)胞器破碎、內(nèi)容物外泄而溶解死亡。引起炎癥反應(yīng)。他殺是一種主動(dòng)的、生理的、程序化的有序過程，涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等作用。凋亡的細(xì)胞最終被吞噬、降解，始終有膜封閉，沒有內(nèi)容物釋放，不會(huì)引起炎癥。自殺細(xì)胞凋亡靜美的細(xì)胞凋亡

—形態(tài)的變化01靜美的細(xì)胞凋亡-形態(tài)的變化細(xì)胞連接消失凋亡小體形成靜美的細(xì)胞凋亡-形態(tài)的變化凋亡小體細(xì)胞被分割成數(shù)個(gè)由質(zhì)膜包裹的、表面光滑的小體，內(nèi)含各種不同的、結(jié)構(gòu)尚保持完整的細(xì)胞器以及染色體斷片等。靜美的細(xì)胞凋亡-形態(tài)的變化凋亡小體被單核巨噬細(xì)胞吞噬，快速降解。整個(gè)過程始終有膜封閉，沒有內(nèi)容物釋放，故不會(huì)引起炎癥。在倒置顯微鏡下，凋亡細(xì)胞體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象。凋亡晚期可見凋亡小體，貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。靜美的細(xì)胞凋亡-形態(tài)的變化

掃描電鏡透射電鏡正常細(xì)胞凋亡細(xì)胞靜美的細(xì)胞凋亡-形態(tài)的變化02靜美的細(xì)胞凋亡

—細(xì)胞核的變化靜美的細(xì)胞凋亡–細(xì)胞核的變化細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，染色質(zhì)會(huì)固縮。Hoechst33342、Hoechst33258或DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下，觀察經(jīng)染色的細(xì)胞。有致密濃染的凋亡細(xì)胞正常細(xì)胞靜美的細(xì)胞凋亡–細(xì)胞核的變化03靜美的細(xì)胞凋亡

—DNA降解靜美的細(xì)胞凋亡–DNA降解凋亡發(fā)生時(shí)，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶基因的活化和表達(dá)，DNA降解。DNA片段可被質(zhì)膜包圍，形成凋亡小體。經(jīng)吖啶橙/溴化乙錠染色，在熒光顯微鏡下清晰可見DNA斷裂時(shí)，暴露的3’-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TerminalDeoxynucleotidylTransferase,TdT)的催化下加上熒光素

(FITC)標(biāo)記的dUTP(fluorescein-dUTP)，從而可以通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。靜美的細(xì)胞凋亡–DNA降解TUNEL法：DNA斷裂的原位末段標(biāo)記法檢測細(xì)胞凋亡靜美的細(xì)胞凋亡–DNA降解靜美的細(xì)胞凋亡–DNA降解彗星電泳實(shí)驗(yàn)：將單個(gè)細(xì)胞懸浮于瓊脂糖凝膠中，經(jīng)裂解處理后，再在電場中進(jìn)行短時(shí)間的電泳。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，DNA發(fā)生特征性的核小體的斷裂，產(chǎn)生大小不同的片斷，但都是180-200bp的整數(shù)倍。凋亡細(xì)胞中提取的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，可見特征性的“梯形”(ladder)條帶現(xiàn)象。靜美的細(xì)胞凋亡–DNA降解04靜美的細(xì)胞凋亡

—細(xì)胞膜的變化靜美的細(xì)胞凋亡–細(xì)胞膜的變化磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine)出現(xiàn)在細(xì)胞膜外側(cè)可作為細(xì)胞凋亡的標(biāo)志。AnnexinV是一種Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與磷脂酰絲氨酸特異性結(jié)合。AnnexinV-FITC作為熒光探針，檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。靜美的細(xì)胞凋亡–細(xì)胞膜的變化碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但是能夠透過凋亡晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞的細(xì)胞膜而使細(xì)胞核呈紅色。靜美的細(xì)胞凋亡–細(xì)胞膜的變化熒光顯微鏡、流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡（AnnexinV-FITC和PI染色）左上區(qū)：

右上區(qū)：

左下區(qū)：

右下區(qū)：壞死或損傷細(xì)胞晚期凋亡細(xì)胞正常細(xì)胞早期凋亡細(xì)胞05靜美的細(xì)胞凋亡

—線粒體的變化靜美的細(xì)胞凋亡–線粒體的變化線粒體在細(xì)胞凋亡的過程中起著樞紐作用線粒體跨膜電位（△Ψm）的下降（羅丹明123染色）細(xì)胞色素C釋放至細(xì)胞質(zhì)（Western檢測細(xì)胞色素c的存在位置）06靜美的細(xì)胞凋亡—胱冬肽酶-3(Caspase-3)

細(xì)胞凋亡–Caspase-3活化胱冬肽酶-3(Caspase-3)在凋亡的早期階段被激活，活化的胱冬肽酶-3可裂解相應(yīng)的胞質(zhì)胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

（Western分析）細(xì)胞凋亡特征檢測方法形態(tài)變化細(xì)胞連接消失、凋亡小體形成顯微鏡、透射電鏡、掃描電鏡觀察細(xì)胞核的變化染色質(zhì)會(huì)固縮DAPI等對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色可見致密濃染DNA降解DNA片段被質(zhì)膜包圍形成凋亡小體經(jīng)吖啶橙/溴化乙錠染色觀察DNA斷裂時(shí)，暴露3’-OHTUNEL法檢測DNA裂解成片斷彗星電泳法DNA片斷為180-200bp的整數(shù)倍“梯形”電泳條帶細(xì)胞膜的變化磷脂酰絲氨酸可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的外側(cè)FITC-Annexin-V與PI配合，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測線粒體的變化線粒體跨膜電位（△Ψm）下降羅丹明123染色熒光的增強(qiáng)或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低細(xì)胞色素C釋放至細(xì)胞質(zhì)COX4定位在線粒體內(nèi)Western標(biāo)示細(xì)胞色素