一、實(shí)驗(yàn)室設(shè)置二、實(shí)驗(yàn)室儀器三、實(shí)驗(yàn)室器皿及用具四、洗滌技術(shù)五、滅菌技術(shù)六、無菌操作技術(shù)現(xiàn)在是1頁\一共有66頁\編輯于星期三

組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室布局的總體要求

便于隔離便于操作便于滅菌便于觀察一、實(shí)驗(yàn)室設(shè)置基本布局規(guī)律根據(jù)實(shí)驗(yàn)操作程序排列實(shí)驗(yàn)室；接種室和培養(yǎng)室設(shè)在與外界環(huán)境隔離性好的區(qū)域；滅菌室與接種室相鄰；其他實(shí)驗(yàn)室的布局可根據(jù)條件，以方便使用為宜?，F(xiàn)在是2頁\一共有66頁\編輯于星期三基本實(shí)驗(yàn)室輔助實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室組成準(zhǔn)備室緩沖室無菌操作室培養(yǎng)室細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室溫室生化分析實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)在是3頁\一共有66頁\編輯于星期三基本實(shí)驗(yàn)室布局平面圖實(shí)驗(yàn)臺(tái)擱架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架藥品及儀器柜無菌臺(tái)無菌臺(tái)擱架拉窗冰箱擱架水槽電爐門4.5m3.0m3.5m4.0m準(zhǔn)備室緩沖室無菌室培養(yǎng)室現(xiàn)在是4頁\一共有66頁\編輯于星期三植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室布局示意圖培養(yǎng)室準(zhǔn)備室滅菌室儲(chǔ)藏室接種室緩沖室現(xiàn)在是5頁\一共有66頁\編輯于星期三組織培養(yǎng)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)在是6頁\一共有66頁\編輯于星期三1.準(zhǔn)備室1.1洗滌間根據(jù)工作量的大小決定其大小，一般面積控制在30-50m2。在實(shí)驗(yàn)室的一側(cè)設(shè)置專用的洗滌水槽，用來清洗玻璃器皿。中央實(shí)驗(yàn)臺(tái)還應(yīng)配置2個(gè)水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大，可以購置一臺(tái)洗瓶機(jī)。準(zhǔn)備1-2個(gè)洗液缸，專門用于洗滌對(duì)潔凈度要求很高的玻璃器皿。此外還應(yīng)配置落水架、干燥箱、柜子、超聲波清洗器等。地面應(yīng)耐濕并排水良好?，F(xiàn)在是7頁\一共有66頁\編輯于星期三超聲波清洗器現(xiàn)在是8頁\一共有66頁\編輯于星期三

面積60平方米左右，配備的主要儀器設(shè)備有：冰箱、天平、微波爐、pH計(jì)、培養(yǎng)基分裝器、藥品柜、器械柜、抽氣泵、電爐、各種規(guī)格的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、移液管、燒杯、量筒、容量瓶、儲(chǔ)藏瓶等。冰箱以體積180-200L為宜，用于儲(chǔ)存培養(yǎng)基母液、激素維生素等貴重藥品、彩色膠卷、及保存植物材料。天平應(yīng)有不同感量。

1.2培養(yǎng)基配制間1.準(zhǔn)備室現(xiàn)在是9頁\一共有66頁\編輯于星期三現(xiàn)在是10頁\一共有66頁\編輯于星期三

配備實(shí)驗(yàn)臺(tái)、高壓滅菌鍋、排風(fēng)滅火設(shè)備、細(xì)菌過濾設(shè)備、干熱消毒柜、電爐等。滅菌鍋的選擇應(yīng)根據(jù)不同的要求選擇不同型號(hào)的滅菌鍋。一般實(shí)驗(yàn)室可選用小型的醫(yī)用手提式高壓滅菌鍋，較大的實(shí)驗(yàn)室可選用立式自動(dòng)控制壓力和溫度的滅菌鍋。生產(chǎn)性的實(shí)驗(yàn)室可選用大型的臥式滅菌鍋。

如果沒有條件的話，可以將上述工作間合并成一個(gè)準(zhǔn)備間，要求是設(shè)備的安裝和排列要合理、房間要寬敞、明亮、透風(fēng)，地面要便于清潔、防滑。

1.3消毒間1.準(zhǔn)備室現(xiàn)在是11頁\一共有66頁\編輯于星期三2.緩沖室現(xiàn)在是12頁\一共有66頁\編輯于星期三無菌操作室主要用于實(shí)驗(yàn)材料的接種操作，所以又叫接種室。通常由里外兩間組成，外間是緩沖間，用于準(zhǔn)備工作，還有防止污染的作用。緩沖間的門應(yīng)該與接種室的門錯(cuò)開，兩個(gè)門也不要同時(shí)開啟，以保證無菌室不因開門和人的進(jìn)出帶進(jìn)雜菌。緩沖間內(nèi)應(yīng)該設(shè)有水槽、實(shí)驗(yàn)臺(tái)、鞋帽架、和柜子、紫外燈。無菌操作室的內(nèi)壁應(yīng)當(dāng)用塑鋼板或瓷磚裝修，工作人員進(jìn)入操作間前要穿上消過毒的工作服和拖鞋。

室內(nèi)應(yīng)配有超凈工作臺(tái)，紫外燈、解剖鏡、各種接種器械等。3.無菌操作室現(xiàn)在是13頁\一共有66頁\編輯于星期三無菌室現(xiàn)在是14頁\一共有66頁\編輯于星期三無菌室現(xiàn)在是15頁\一共有66頁\編輯于星期三

為了控制培養(yǎng)室的溫度和光照時(shí)間及其強(qiáng)度，培養(yǎng)室的房間不要窗戶，但應(yīng)當(dāng)留一個(gè)通氣窗，并安上排氣扇。室內(nèi)溫度由空調(diào)控制，光照由日光燈控制。天花板和內(nèi)墻最好用塑料鋼板裝修，地面用水磨石或瓷磚鋪設(shè)，一般要分兩間，一為光照培養(yǎng)室，一為暗培養(yǎng)。

培養(yǎng)室外應(yīng)有一預(yù)備間或走廊。

培養(yǎng)室應(yīng)配有培養(yǎng)架、轉(zhuǎn)床、搖床、光照培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、自動(dòng)控時(shí)器等。日光燈一般用40W，固定在培養(yǎng)架的側(cè)面或擱板的下面，每層有兩支日光燈，距離在20cm，光照強(qiáng)度為2000-3000lx。

4.培養(yǎng)室現(xiàn)在是16頁\一共有66頁\編輯于星期三設(shè)計(jì)組培實(shí)驗(yàn)室時(shí)的注意事項(xiàng)為了減少污染，實(shí)驗(yàn)室最好設(shè)一走廊且走廊上方最好安裝紫外燈；培養(yǎng)室最好設(shè)在南面，設(shè)大玻璃窗，以雙層玻璃窗為最好。如果培養(yǎng)室是設(shè)在房屋的邊側(cè)，其東邊或西邊的墻上也可設(shè)置大玻璃窗；培養(yǎng)室房間及門要小，而且密閉性要好，最好裝移門；無菌操作室要小，要設(shè)緩沖間，也最好裝移門，且門要稍大一些?，F(xiàn)在是17頁\一共有66頁\編輯于星期三二、儀器與設(shè)備1、基本設(shè)備

冰箱、電爐、酸度計(jì)、純水器、天平、培養(yǎng)基分裝器、攪拌器等?，F(xiàn)在是18頁\一共有66頁\編輯于星期三酸度計(jì)電熱套現(xiàn)在是19頁\一共有66頁\編輯于星期三天平現(xiàn)在是20頁\一共有66頁\編輯于星期三培養(yǎng)基分裝器攪拌器現(xiàn)在是21頁\一共有66頁\編輯于星期三2、滅菌設(shè)備蒸汽壓力滅菌鍋、干熱消毒柜、過濾滅菌裝置、噴霧消毒器、紫外燈?，F(xiàn)在是22頁\一共有66頁\編輯于星期三蒸汽壓力滅菌鍋現(xiàn)在是23頁\一共有66頁\編輯于星期三干熱消毒柜

利用高溫干熱對(duì)微生物有氧化、蛋白質(zhì)變性、電介質(zhì)濃縮引起中毒等作用。其中主要是通過氧化作用破壞細(xì)胞原生質(zhì)，使微生物死亡，所以在一定的加熱時(shí)間內(nèi)可殺死一切微生物?，F(xiàn)在是24頁\一共有66頁\編輯于星期三無菌瓶頂過濾裝置噴霧消毒器（參考圖）（參考圖）現(xiàn)在是25頁\一共有66頁\編輯于星期三接種器具消毒器現(xiàn)在是26頁\一共有66頁\編輯于星期三3、無菌操作設(shè)備

超凈工作臺(tái)現(xiàn)在是27頁\一共有66頁\編輯于星期三無菌接種箱現(xiàn)在是28頁\一共有66頁\編輯于星期三4、細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備搖床現(xiàn)在是29頁\一共有66頁\編輯于星期三培養(yǎng)架現(xiàn)在是30頁\一共有66頁\編輯于星期三恒溫振蕩培養(yǎng)箱

光照培養(yǎng)箱現(xiàn)在是31頁\一共有66頁\編輯于星期三5、細(xì)胞學(xué)鑒定設(shè)備光學(xué)研究顯微鏡、實(shí)體顯微鏡、倒置顯微鏡倒置顯微鏡光學(xué)顯微鏡現(xiàn)在是32頁\一共有66頁\編輯于星期三1、玻璃器皿三、培養(yǎng)器皿及實(shí)驗(yàn)用具培養(yǎng)皿三角瓶培養(yǎng)瓶現(xiàn)在是33頁\一共有66頁\編輯于星期三2、金屬材質(zhì)用具鑷子解剖刀接種針現(xiàn)在是34頁\一共有66頁\編輯于星期三1、玻璃器皿洗滌新購置玻璃器皿1%稀HCl浸漬12h洗衣粉洗滌清水沖洗晾干備用已用過的玻璃器皿四、洗滌技術(shù)現(xiàn)在是35頁\一共有66頁\編輯于星期三清洗后器皿內(nèi)外不可掛有水珠，否則重洗，若重洗后仍掛有水珠，則需用洗液浸泡數(shù)小時(shí)后（或用去污粉擦洗），重新清洗。

現(xiàn)在是36頁\一共有66頁\編輯于星期三2、塑料用品洗滌新的塑料器皿打開即用已用過的塑料器皿2%NaOH浸泡12h清水沖洗2%—5%鹽酸浸泡30min清水沖洗蒸餾水沖洗晾干備用現(xiàn)在是37頁\一共有66頁\編輯于星期三

金屬用品一般不宜用各種洗滌液洗滌（新的可以用熱洗衣粉水洗凈），需要清洗時(shí)，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。3、金屬用品洗滌現(xiàn)在是38頁\一共有66頁\編輯于星期三

（一）、滅菌工作是極其重要的。

首先應(yīng)建立有菌和無菌的概念有菌的范疇：

有菌：凡是暴露在空氣中的物體，至少其表面都是有菌的。如植物的表面、超凈工作臺(tái)的臺(tái)面，未處理的工具和手等。

無菌：高壓高溫處理（工具、器皿、培養(yǎng)基等）

物理或化學(xué)處理；

火烤后的物體；

健康的動(dòng)植物不與內(nèi)外部表面接觸的組織

內(nèi)部可能是無菌的（有時(shí)也有內(nèi)生菌，但

不會(huì)影響培養(yǎng)，也不會(huì)污染）

五.滅菌技術(shù)現(xiàn)在是39頁\一共有66頁\編輯于星期三1、物理方法：干熱、濕熱、過濾（0.25微米）紫外燈、超聲波等。

2、化學(xué)方法：使用滅菌劑或抗菌素，如酒精、次氯酸鈉、升汞、漂白粉、高錳酸鉀、雙氧水、福爾馬林等。

五.滅菌技術(shù)現(xiàn)在是40頁\一共有66頁\編輯于星期三干熱滅菌玻璃器皿、器械濕熱滅菌培養(yǎng)基、蒸餾水、器械、棉塞等熏蒸滅菌接種室、培養(yǎng)室過濾滅菌液體培養(yǎng)基、蒸餾水藥劑滅菌培養(yǎng)材料燒灼滅菌器械、瓶口、棉塞、包頭紙輻射滅菌

接種室、培養(yǎng)間（一）各種滅菌方法及其使用范圍現(xiàn)在是41頁\一共有66頁\編輯于星期三

適用于玻璃器皿和金屬器械的滅菌。操作方法：150℃、40min或120℃、120min，如果發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌，160℃、90～120min（1）干熱滅菌現(xiàn)在是42頁\一共有66頁\編輯于星期三

適用于各種器皿、培養(yǎng)基、器皿、蒸餾水、棉塞、紙等。121℃維持20～30min

注意點(diǎn)：加足水、排盡氣、氣壓降到0時(shí)，才能開蓋。（2）濕熱滅菌現(xiàn)在是43頁\一共有66頁\編輯于星期三

培養(yǎng)基的滅菌一般用高壓高溫處理，但如果培養(yǎng)基中某些成分遇到高溫分解（如某些生長調(diào)節(jié)劑GA3、玉米素等），就需要過濾滅菌。另外酶、血清等也需要過濾滅菌。

滅菌方法：將生長調(diào)節(jié)劑或酶配成一定濃度，用注射器注入微孔濾膜慮，濾膜孔徑0.22～0.45微米。制培養(yǎng)基時(shí)，現(xiàn)將培養(yǎng)基高壓滅菌，待降至50℃左右時(shí)，加入適量的激素，然后分裝。

（3）過濾滅菌現(xiàn)在是44頁\一共有66頁\編輯于星期三主要是利用紫外燈進(jìn)行照射，適合實(shí)驗(yàn)室空氣、操作臺(tái)等，滅菌時(shí)間20～30min。

注意：關(guān)燈后5min后再進(jìn)入。超凈工作臺(tái)關(guān)燈后要打開風(fēng)機(jī)。（4）射線滅菌現(xiàn)在是45頁\一共有66頁\編輯于星期三

用火焰灼燒達(dá)到滅菌目的，適用于接種器皿的滅菌。（5）火焰灼燒滅菌現(xiàn)在是46頁\一共有66頁\編輯于星期三

適用外植體、實(shí)驗(yàn)器皿、操作表面、皮膚等。

幾種常用消毒劑的效果比較

消毒劑使用濃度(%)消毒時(shí)間(min.)效果殘液去除難易乙醇70-750.1-3好易新潔爾滅10～205～30好易氯化汞0.1～12～15最好最難過氧化氫10～125～15較好最易抗菌素4～50mgl-130～60較好較難次氯酸鈣/納9～105～30好易（6）消毒劑現(xiàn)在是47頁\一共有66頁\編輯于星期三

長期不用的培養(yǎng)室或接種室要進(jìn)行熏蒸。方法：甲醛、高錳酸鉀熏蒸。

甲醛的用量通常按每立方米空間2-6毫升計(jì)算，高錳酸鉀的用量是甲醛的一半。室內(nèi)準(zhǔn)備妥當(dāng)后，把稱好的高錳酸鉀放在瓷碗或燒杯內(nèi)(最好在碗或杯下面鋪一張報(bào)紙，以利清洗)，然后將甲醛也倒入碗或杯內(nèi)，立即出屋關(guān)門。幾秒鐘后，甲醛溶液即沸騰揮發(fā)。高錳酸鉀是一種氧化劑，當(dāng)它與一部分甲醛作用時(shí)，由氧化反應(yīng)產(chǎn)生的熱可使其余的甲醛揮發(fā)為氣體。（7）熏蒸滅菌現(xiàn)在是48頁\一共有66頁\編輯于星期三

甲醛熏蒸接種室應(yīng)至少在使用前24小時(shí)進(jìn)行，熏蒸后密閉保持4小時(shí)以上再進(jìn)入室內(nèi)工作。甲醛對(duì)人的眼、鼻有強(qiáng)烈刺激作用。因此，可在使用前用氨進(jìn)行中和。取與甲醛等量的氨水，倒在另一個(gè)燒杯里，迅速放入熏蒸室內(nèi)，使甲醛和氨水發(fā)生中和反應(yīng)，以消除甲醛味，減少對(duì)人體的刺激作用。使用氨水應(yīng)在工作前2小時(shí)進(jìn)行。

對(duì)有材料的培養(yǎng)室，也可以采用乙二醇加熱熏蒸。現(xiàn)在是49頁\一共有66頁\編輯于星期三（二）接種室滅菌空氣消毒滅菌接種室超凈工作臺(tái)紫外燈照射70%—75%的酒精擦洗培養(yǎng)材料的接種紫外燈照射現(xiàn)在是50頁\一共有66頁\編輯于星期三（三）外植體滅菌流水沖洗10—20min或更長時(shí)間70%—75%酒精中浸泡30s0.1%—0.2%氯化汞液中浸泡10min左右蒸餾水沖洗4—5次在10%的次氯酸鈉、飽和漂白粉浸泡30min左右備用現(xiàn)在是51頁\一共有66頁\編輯于星期三常用消毒劑消毒滅菌比較表消毒劑使用濃度（%）去除難易消毒時(shí)間（min）效果次氯酸鈣次氯酸鈉漂白粉溴水過氧化氫升汞酒精抗生素硝酸銀9~102飽和溶液1~210~120.1~170~754~5（mg/L1易易易易最易較難易中較難5~305~305~302~105~152~100.2~230~605~30很好很好很好很好好最好好較好好現(xiàn)在是52頁\一共有66頁\編輯于星期三污染來源人為因素（工作人員本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。物品因素器皿和用具培養(yǎng)皿：洗→熱壓玻璃器皿：洗→干熱（干熱箱）或晾干接種用具：用CCL4布擦→濕布擦→泡75%~95%酒精→燒培養(yǎng)基：濕熱培養(yǎng)材料外部細(xì)菌：用水沖洗→化學(xué)藥劑處理內(nèi)部細(xì)菌莖尖培養(yǎng)加抗生素：青霉素、利福平操作的空氣：洗刷地板95%酒精擦超凈工作臺(tái)用化學(xué)試劑薰蒸六、無菌操作技術(shù)

現(xiàn)在是53頁\一共有66頁\編輯于星期三

1、實(shí)驗(yàn)器具和材料的準(zhǔn)備

2、用75%的酒精擦拭超凈工作臺(tái)，然后室內(nèi)及超凈工作臺(tái)用紫外燈殺菌20min-30min。注意：臺(tái)面上的用品不要放置太多或重疊放置，以免降低滅菌效果。

3、關(guān)紫外燈、打開風(fēng)機(jī)，過5-10min進(jìn)入緩沖間，以75%洗手和手臂，更換無菌服、帽子和口罩。進(jìn)入接種室。（注：沒有特別情況，盡量不要下工作臺(tái)）

六、無菌操作技術(shù)

現(xiàn)在是54頁\一共有66頁\編輯于星期三

4、用70－75％的酒精拭擦臺(tái)面并消毒雙手。試驗(yàn)用具也應(yīng)該用酒精消毒。點(diǎn)燃酒精燈，將金屬器械在其火焰上灼燒，冷卻待用。

注意：所有操作應(yīng)在火焰近處并經(jīng)過灼燒進(jìn)行。金屬器械不能過度灼燒，以防退火。移液管不能灼燒，培養(yǎng)瓶口、塑料材料、橡膠材料過火焰不能時(shí)間太長?，F(xiàn)在是55頁\一共有66頁\編輯于星期三5、取流水沖洗（至少30min）過的外植體，用一定的消毒劑浸泡消毒，用無菌水沖洗3~4次，放入無菌培養(yǎng)皿中，置于酒精燈火焰下方，用無菌的接種器械進(jìn)行分離、切割或其他處理。

6、打開培養(yǎng)瓶，瓶口在燈焰處旋轉(zhuǎn)灼燒，用鑷子將培養(yǎng)材料置于培養(yǎng)基上，灼燒鑷子放回，灼燒瓶口，蓋上瓶塞。

7、用酒精擦洗工作臺(tái)和手。進(jìn)行下一輪操作。現(xiàn)在是56頁\一共有66頁\編輯于星期三注意（1）進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。（2）不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。（3）為拿取方便，工作臺(tái)面上的用品要有合理的布局，原則上應(yīng)是右手使用的東西放置在右側(cè)，左手用品在左側(cè)，酒精燈置于中央。（4）工作由始至終要保持一定順序性，組織或細(xì)胞在未做處理之前，勿過早暴露在空氣中。同樣，培養(yǎng)液在未用前，不要過早開瓶；用過之后如不再重復(fù)使用，應(yīng)立即封閉瓶口直立可增加落菌機(jī)會(huì)?，F(xiàn)在是57頁\一共有66頁\編輯于星期三（5）吸取營養(yǎng)液、細(xì)胞懸液及其它各種用液時(shí)，均應(yīng)分別使用吸管，不能混用，以防擴(kuò)大污染或?qū)е录?xì)胞交叉污染。

（6）工作中不能面向操作區(qū)講話或咳嗽，