生化物質(zhì)的制備第1頁/共47頁提取與沉淀分離技術(shù)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院生化分析與實(shí)驗(yàn)第2頁/共47頁

生化物質(zhì)（生命大分子物質(zhì)）通常是指動(dòng)物、植物和微生物在進(jìn)行生長發(fā)育、新陳代謝時(shí)，所形成的蛋白質(zhì)（包括酶）和核酸等有機(jī)化合物的總稱。

生化物質(zhì)的提取與沉淀分離技術(shù)第3頁/共47頁

生化物質(zhì)的特點(diǎn)：1、生化物質(zhì)組成非常復(fù)雜。其中包括數(shù)百種甚至數(shù)千種化合物，并且在分離過程中，這些化合物仍在發(fā)生代謝變化，如蛋白質(zhì)和核酸的水解。2、有些化合物的含量極微，如激素等。3、許多具有生物活性的物質(zhì)一旦離開活體，很易變性破壞，因此常選用比較溫和的條件進(jìn)行制備。第4頁/共47頁第一節(jié)生物材料的選擇（一）選擇生物材料的原則：有效成分含量多，穩(wěn)定性好；來源豐富，保持新鮮；提取方法簡單；有綜合利用價(jià)值等。（二）生物材料一般可以分為兩大類：

天然生物材料人工生物材料第5頁/共47頁天然生物材料一般是指在自然界易采集的、目的物含量較高的生物個(gè)體、器官或組織。人工生物材料又分為三種：

1、新品種材料

2、組織培養(yǎng)材料

3、生物產(chǎn)品與生物制品材料第6頁/共47頁（三）蛋白質(zhì)原料的選擇

如何提高制備天然蛋白質(zhì)的品質(zhì)、產(chǎn)量和降低成本？種屬、發(fā)育階段、生物狀態(tài)、來源、解剖部位、生物技術(shù)產(chǎn)品的宿主菌或細(xì)胞第7頁/共47頁1．種屬

豬胰臟中單位含量3000IU／kg牛胰臟中單位含量4000IU／kg抗原性方面豬胰島素比牛胰島素低，前者與人胰島素相比，只有1個(gè)氨基酸的差異，而牛有3個(gè)氨基酸的差異。胰島素（isulin)

PK第8頁/共47頁2．發(fā)育階段

幼年動(dòng)物的胸腺比較發(fā)達(dá)，老齡后逐漸萎縮，因此胸腺原料必須采自幼齡動(dòng)物。

胸腺（thyums）－胸腺素－調(diào)節(jié)免疫功能第9頁/共47頁3．生物狀態(tài)

動(dòng)物飽食后宰殺，胰臟中的胰島素含量增加，對(duì)提取胰島素有利，但膽囊收縮素的分泌使膽汁排空，對(duì)膽汁的收集不利。

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4．原料來源

血管舒緩素可分別從豬胰臟和豬顎下腺中提取，兩者生物學(xué)功能并無二致，而穩(wěn)定性以顎下腺來源為好，因其不含蛋白水解酶。第11頁/共47頁5．原料解剖學(xué)部位

豬胰臟中，胰尾部分含激素較多，而胰頭部分含消化酶較多。如分別摘取則可提高各產(chǎn)品的收率。

胃膜素以采取全胃粘膜為好，胃蛋白酶(pepsin)則以采取胃底部粘膜為好，因胃底部粘膜富含消化酶。

第12頁/共47頁6.從簡化提純步驟著手

如從鴿肝中提取乙酰化酶，需將動(dòng)物饑餓后取材，可減少肝糖原，以簡化純化步驟。第13頁/共47頁7．對(duì)生物技術(shù)產(chǎn)品宿主菌或細(xì)胞的要求

選擇生物技術(shù)產(chǎn)品的宿主受體菌或細(xì)胞也應(yīng)考慮到后處理的問題。大腸桿菌表達(dá)；（分泌，毒素）枯草桿菌或酵母菌表達(dá)；（糖基化）動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞表達(dá)第14頁/共47頁第二節(jié)細(xì)胞及組織的破碎

細(xì)胞及組織破碎的方法多種多樣，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮筒牧系牟煌梢圆捎貌煌募?xì)胞破碎方法：（一）機(jī)械破碎方法：

主要通過機(jī)械運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生的剪切力的作用，使組織或細(xì)胞破碎的方法。

搗碎法、研磨法、勻漿法第15頁/共47頁第16頁/共47頁（二）物理破碎方法1.溫度差破碎法（反復(fù)凍融法）

把待破碎的樣品迅速冷至－15～－20℃，使之凝固，然后緩慢地溶解，如此反復(fù)操作，大部分組織細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的顆粒可以破碎。也采用先高溫然后突然冷凍的方法。通過溫度、壓力、聲波等各種物理因素的作用，使組織細(xì)胞破碎的方法。第17頁/共47頁2.壓力差破碎法高壓沖擊法、突然降壓法、滲透壓變化法

加氣壓或水壓達(dá)20.59～34.32MPa的壓力時(shí)，可使90%以上細(xì)胞被壓碎。（1.013×105Pa＝10.336m水柱）第18頁/共47頁第19頁/共47頁3．超聲波處理法

多用于微生物材料，處理的效果與樣品濃度、使用頻率有關(guān)。操作中注意避免溶液中氣泡的存在，制備對(duì)超聲波敏感的一些核酸、酶，要慎重使用。第20頁/共47頁（三）化學(xué)破碎法有機(jī)溶劑：可以使細(xì)胞膜的磷脂結(jié)構(gòu)破壞，從而改變細(xì)胞膜的透過性。表面活性劑：表面活性劑的分子中，兼有親脂性和親水性基團(tuán)，能降低水的界面張力，具有乳化、分散、增溶作用。較常用的有十二烷基硫酸鈉(SDS)、去氧膽酸鈉、特立頓（Triton）、吐溫（Tween）等。第21頁/共47頁1.自溶法

即新鮮的生物材料存放在一定的pH和適當(dāng)溫度下，利用組織細(xì)胞中自身的酶系將細(xì)胞破壞，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來的方法。自溶的溫度，動(dòng)物材料選在0～4℃，微生物材料則多在室溫下進(jìn)行。（四）酶促破碎法

通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞。第22頁/共47頁2．酶處理法

用外來酶處理生物材料：溶菌酶是專一地破壞革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁的酶；β-葡聚糖酶用于酵母細(xì)胞的破碎；用于專一性分解細(xì)胞壁的酶還有纖維素酶（破壞植物細(xì)胞）、細(xì)菌蛋白酶、酯酶、殼糖酶等。第23頁/共47頁第三節(jié)生物分子的提取提?。菏侵冈谝欢ǖ臈l件下，用適當(dāng)?shù)娜軇ㄈ芤海┨幚碓?，使欲分離物質(zhì)充分溶解到溶劑（溶液）中的過程，也稱為抽提。提取液應(yīng)具備的條件：對(duì)有效成分溶解度大，破壞作用?。粚?duì)雜質(zhì)溶解度小或不溶解；來源廣泛、價(jià)格低廉、操作安全等。第24頁/共47頁

生物分子可以分為：生物大分子和生物小分子

生物小分子的結(jié)構(gòu)由較強(qiáng)的共價(jià)鍵決定；

生物大分子中除共價(jià)鍵外，還含有較弱的共價(jià)鍵和次級(jí)鍵，故需溫和的條件才能保證生物大分子的活性不被破壞。第25頁/共47頁（一）提取方法1.鹽溶液提?。蝴}溶現(xiàn)象與鹽析現(xiàn)象2.酸溶液提取3.堿溶液提取4.有機(jī)溶劑提取第26頁/共47頁

分子在其等電點(diǎn)時(shí)，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入鹽離子會(huì)破壞這些吸引力，使分子離散，溶入水中。第27頁/共47頁（二）影響提取的因素1.溶解度（溶劑的性質(zhì)）：根據(jù)相似相溶原理2.擴(kuò)散速度：與溫度、黏度、擴(kuò)散面積、擴(kuò)散距離、濃度差有關(guān)。3.溫度：注意蛋白、核酸等分子的變性失活。4.

PH值：等電點(diǎn)（pI）兩性電解質(zhì)5.提取液的體積：提取液為原料液的3-5倍，多次提取第28頁/共47頁第四節(jié)：生物分子的濃縮（沉淀分離）1、沉淀法:是通過改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使某溶質(zhì)在溶液中的溶解度降低，從溶液中沉淀析出，再經(jīng)過離心或過濾收集沉淀物。

A.鹽析法；硫酸銨鹽析注意事項(xiàng)

B.等電點(diǎn)沉淀法；pI（isoelectricpoint）

C.有機(jī)溶劑沉淀法；乙醇，異丙醇

D.復(fù)合沉淀法；PEG（聚乙二醇）

E.金屬鹽沉淀法；

F.選擇性變性沉淀法。

第29頁/共47頁蛋白質(zhì)分子表面的疏水性區(qū)域都聚集許多水分子，當(dāng)大量鹽類加入時(shí)這些水分子被抽出，以便與鹽離子進(jìn)行水合，暴露出來的疏水性區(qū)域相互結(jié)合形成沉淀。第30頁/共47頁2、吸附法：將干葡聚糖凝膠加入提取液中，由于凝膠吸水，提取液的體積可縮小三倍左右。3、超過濾法：把提取液裝入過濾裝置，在空氣或氮?dú)獾膲毫ο?，使小分子物質(zhì)通過半透膜，大分子物質(zhì)留在膜內(nèi)。第31頁/共47頁4.透析濃縮法1、原理：天然或人工半透膜只允許小分子通過而阻礙大分子通過。當(dāng)膜的兩側(cè)存在小分子濃度梯度差時(shí)，小分子就從高濃度一側(cè)向低濃度一側(cè)擴(kuò)散，直至達(dá)到平衡，如果能不斷去除擴(kuò)散出來的小分子，從而達(dá)到分離純化的目的。第32頁/共47頁第33頁/共47頁影響透析的因素

1、半透膜的通透性：半透膜的通透性取決于膜孔徑的大小，在能阻礙大分子擴(kuò)散的前提下，孔徑越大，透析速度越快。

2、透析外液的更換

3、溫度：溫度越高，透析速度越快。

4、壓力：用跨膜的壓力梯度可加速大分子的分離速度。第34頁/共47頁5、減壓蒸餾濃縮法：將提取液裝入減壓蒸餾裝置中，在減壓真空狀態(tài)下進(jìn)行蒸餾。第35頁/共47頁旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀第36頁/共47頁6、冰凍干燥法第37頁/共47頁第38頁/共47頁第39頁/共47頁第40頁/共47頁濃縮實(shí)例（一）、硫酸氨鹽析法1.原理：根據(jù)蛋白質(zhì)在稀鹽溶液中溶解度會(huì)隨著鹽濃度的增高而上升（鹽溶），但當(dāng)鹽濃度增高到一定數(shù)值時(shí)，其溶解度又逐漸下降，直至蛋白質(zhì)析出，鹽析的發(fā)生在于鹽濃度增高到一定數(shù)值時(shí)，使水活度降低，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表面電荷逐漸被中和，水化膜逐漸被破壞，最終引起蛋白質(zhì)分子之間相互聚集并從溶液中析出。第41頁/共47頁2、影響蛋白質(zhì)鹽析的因素（１）蛋白質(zhì)濃度對(duì)鹽析的影響：蛋白質(zhì)濃度過大，鹽析時(shí)發(fā)生共沉現(xiàn)象，分離效果不好；蛋白質(zhì)濃度太稀，耗鹽量過大，蛋白質(zhì)回收率也低。一般為2.5%-3.0%的蛋白質(zhì)濃度較適中。（２）離子強(qiáng)度和離子類型對(duì)鹽析的影響：離子強(qiáng)度越大，蛋白質(zhì)的溶解度越低，越容易產(chǎn)生鹽析現(xiàn)象；離子半徑小而價(jià)數(shù)高的離子在鹽析方面影響較強(qiáng)，離子半徑大而價(jià)數(shù)低的離子對(duì)鹽析影響弱。第42頁/共47頁（３）ＰＨ對(duì)鹽析的影響：蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多，溶解度越大；在凈電荷為零時(shí)，溶解度最低。一般將ＰＨ值調(diào)到蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近，這樣有利于鹽析。第43頁/共47頁（二）、有機(jī)溶劑沉淀法1、原理：

有機(jī)溶劑對(duì)許多溶于水的小分子生化物質(zhì)以及核酸、多糖、蛋白質(zhì)等生物大分子都能發(fā)生沉淀作用。

對(duì)于具有表面水層的生物大分子來說，