酶細(xì)胞原生質(zhì)體的固定化第1頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二第2頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二固定化生物技術(shù)——

通過化學(xué)或物理的手段將酶或游離細(xì)胞定位于限定的空間區(qū)域內(nèi)，使其保持活性并可反復(fù)利用。第3頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二游離酶的缺點(diǎn)1.酶是蛋白質(zhì)，穩(wěn)定性差（熱、酸堿、有機(jī)溶劑對(duì)其有影響）。2.不能回收，也使產(chǎn)物中混雜酶蛋白。3.分離純化困難。第4頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)酶與細(xì)胞的固定化一、固定化酶和固定化細(xì)胞的定義及特點(diǎn)

1.固定化酶(immobilizedenzyme)

固定在載體上并在一定空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶。第5頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性載體水不溶性酶（固定化酶）固定化技術(shù)第6頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二優(yōu)點(diǎn)：(1)可提高穩(wěn)定性。(2)能回收，易與產(chǎn)物分離，可反復(fù)使用。缺點(diǎn)：(1)存在擴(kuò)散限制。適于催化小分子物質(zhì)。(2)酶活性下降。第7頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二

2.固定化細(xì)胞（immobilizedcell）

固定在載體上并在一定空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)（生長、繁殖、新陳代謝）的細(xì)胞。第8頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二

優(yōu)越性：

(1)降低成本，省去酶的分離純化工作;(2)既可作為單一酶，也可作為復(fù)合酶系完成部分代謝過程。

局限性：(1)細(xì)胞內(nèi)多種酶的存在，會(huì)形成不需要的副產(chǎn)物。(2)細(xì)胞膜、細(xì)胞壁和載體都存在著擴(kuò)散限制作用。第9頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二

3.固定化原生質(zhì)體意義：(1)固定化原生質(zhì)體去除了細(xì)胞壁的擴(kuò)散障礙，有利于氧的傳遞，營養(yǎng)成分的吸收和胞內(nèi)產(chǎn)物的分泌。(2)原生質(zhì)體不穩(wěn)定，容易破裂，固定化后，由于載體的保護(hù)作用，穩(wěn)定性提高。第10頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二

二、固定化方法固定化方法（一）酶的固定化方法吸附法共價(jià)偶聯(lián)法交聯(lián)法包埋法網(wǎng)格型微囊型離子交換吸附物理吸附法第11頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二依據(jù)帶電的酶或細(xì)胞和載體之間的靜電作用，使酶吸附于惰性固體的表面或離子交換劑上。1.吸附法（adsorption）第12頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二根據(jù)吸附劑的特點(diǎn)分:1）物理吸附法（physicaladsortion）作用力：氫鍵、疏水鍵常用載體：氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石、纖維素等。2）離子結(jié)合法（ionbinding）作用力：離子鍵常用載體：DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠、CM-

纖維素第13頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二優(yōu)點(diǎn)：條件溫和，操作簡便，酶活力損失少。缺點(diǎn)：結(jié)合力弱，易解吸附。第14頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二借助共價(jià)鍵將酶的活性非必需側(cè)鏈基團(tuán)和載體的功能基團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)。2.共價(jià)偶聯(lián)法（covalentbindingorcovalentcoupling）

第15頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二

1）載體：親水載體優(yōu)于疏水載體

如:天然高分子衍生物:

纖維素葡聚糖凝膠親和性好，機(jī)械性能差瓊脂糖合成聚合物：聚丙烯酰胺 聚苯乙烯機(jī)械性能好，但有疏水結(jié)構(gòu)尼龍第16頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二2）偶聯(lián)方法：偶聯(lián)成功與否取決于： 載體：功能基團(tuán)：芳香氨基，羧基，羧甲基等。酶分子:側(cè)鏈非必需基團(tuán)：羧基，巰基，羥基，酚基，咪唑基。 第17頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二

常用的偶聯(lián)反應(yīng)有：重氮化法、疊氮法、溴化氰法、烷基化法等。第18頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二優(yōu)點(diǎn)：酶與載體結(jié)合牢固，不會(huì)輕易脫落，可連續(xù)使用。缺點(diǎn)：反應(yīng)條件較激烈，易影響酶的空間構(gòu)象而影響酶的催化活性。

第19頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二3.交聯(lián)法（crosslinking）借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)的固定化方法。雙功能試劑：

常用的是戊二醛

O

O H—C—CH2—CH2—

CH2—

C—H第20頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二

戊二醛有兩個(gè)醛基，均可與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基反應(yīng),使酶蛋白交聯(lián)。

此法與共價(jià)偶聯(lián)法利用的均是共價(jià)鍵，不同之處：交聯(lián)法不使用載體。第21頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二

交聯(lián)反應(yīng)既能發(fā)生在分子間，也可發(fā)生在分子內(nèi)。酶濃度低時(shí)，交聯(lián)發(fā)生在分子內(nèi)，酶仍保持溶解狀態(tài)。

酶濃度高時(shí)，交聯(lián)發(fā)生在分子間，酶變?yōu)椴蝗軕B(tài)。第22頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二

缺點(diǎn)：(1)反應(yīng)條件激烈，酶分子的多個(gè)基團(tuán)被交聯(lián)，酶活力損失大。(2)制備的固定化酶顆粒較小，給使用帶來不便。

第23頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二4.包埋法（entrapment）

將酶用物理的方法包埋在各種載體（高聚物）內(nèi)。分為：網(wǎng)格型：將酶包埋在高分子凝膠細(xì)微網(wǎng)格中。微囊型：將酶包埋在高分子半透膜中。第24頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二1）網(wǎng)格型包埋法（gel(lattic)entrapment）又稱凝膠包埋法凝膠包埋條件酶活性強(qiáng)度天然凝膠瓊脂、海藻酸鈣、角叉菜膠、明膠溫和不變差合成凝膠聚丙烯酰胺、光交聯(lián)樹脂聚合反應(yīng)部分失活高使用的多孔載體及其特點(diǎn)第25頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二海藻酸鈣凝膠包埋法：滴至海藻酸鈉溶液＋E(orcell)CaCl2溶液中IE(orIC)

角叉菜膠包埋法：滴至角叉菜膠＋E(orcell)KCl

溶液中IE(orIC)聚丙烯酰胺凝膠包埋法：

APAcr+Bis+E(orcell)IE(orIC)TEMED第26頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二2）微囊型包埋法（microencapsulation）

又稱半透膜包埋法將一定量酶液包在半透性的高分子微孔膜內(nèi)。半透膜：直徑幾十微米到幾百微米，厚約25nm。半透膜孔徑<酶分子孔徑，小于半透膜孔徑的小分子底物和產(chǎn)物可以自由進(jìn)出，被稱為“人工細(xì)胞”。第27頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二

與網(wǎng)格型包埋法相比，微囊型包埋法的優(yōu)點(diǎn)：1）固定化酶顆粒小，有利于底物和產(chǎn)物擴(kuò)散。2）半透膜能阻止蛋白質(zhì)分子滲漏和進(jìn)入，注入體內(nèi)既可避免引起免疫過敏反應(yīng)，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有較大的醫(yī)學(xué)價(jià)值。

缺點(diǎn)：反應(yīng)條件要求高,制備成本也較高。

第28頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二

包埋法是目前應(yīng)用最多的一種較理想的方法，與其它固定化方法相比：優(yōu)點(diǎn)：不與酶蛋白氨基酸殘基反應(yīng)，很少改變酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)，酶活回收率高。缺點(diǎn)：只適合作用于小分子底物和產(chǎn)物的酶。第29頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二

吸附法共價(jià)偶聯(lián)法

交聯(lián)法

包埋法

酶的四種固定化方法第30頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二第31頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二固定化方法吸附法包埋法共價(jià)結(jié)合法交聯(lián)法物理吸附法離子吸附法制備難易易易較難難較難結(jié)合程度弱中等強(qiáng)強(qiáng)強(qiáng)活力回收高，酶易流失高高低中等再生可能可能不能不能不能費(fèi)用低低低高中等底物專一性不變不變不變可變可變各種固定化方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較第32頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二分類方式固定化細(xì)胞分類方式固定化細(xì)胞細(xì)胞類型微生物植物動(dòng)物生理狀態(tài)死細(xì)胞:完整細(xì)胞,細(xì)胞碎片,細(xì)胞器活細(xì)胞:增殖細(xì)胞,靜止細(xì)胞,饑餓細(xì)胞（二）細(xì)胞的固定化方法

1.固定化細(xì)胞的分類第33頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二

1)直接固定法

不使用載體，借助物理（如加熱、冰凍）、化學(xué)方法（如檸檬酸、各種絮凝劑）將細(xì)胞直接固定。一般只用于單酶或少數(shù)幾種酶催化的反應(yīng)。

2)吸附法

3)包埋法

2.固定化方法第34頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二

例如：葡萄糖異構(gòu)酶(白色鏈霉菌)，是一種胞內(nèi)酶。在50--80℃加熱10分鐘，使菌體自溶作用的酶失活，而葡萄糖異構(gòu)酶仍然保持活性，長期使用酶活力不減少。第35頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二實(shí)驗(yàn)：

2.4%左右的卡拉膠，70℃溶解,再冷卻到42℃,+10%左右的細(xì)菌菌體(預(yù)熱到42℃）

迅速混合均勻

4℃冰箱放置大約30min

取出后切成3×3mm的小顆粒

第36頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二

一般采用網(wǎng)格包埋法（即凝膠包埋法）。常用凝膠：瓊脂凝膠，海藻酸鈣凝膠，角叉菜膠和光交聯(lián)樹脂。注意：一般要加滲透壓穩(wěn)定劑，以防止原生質(zhì)體破裂。（三）原生質(zhì)體的固定化方法第37頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)

固定化酶和固定化細(xì)胞

的性質(zhì)與表征一、固定化酶的性質(zhì)

影響酶催化活性的因素

1.構(gòu)象改變或立體屏蔽以及微擾

2.分配效應(yīng)和擴(kuò)散限制效應(yīng)第38頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二第39頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二

（一）酶的活性：

通常低于天然酶（有例外）。

（二）酶的穩(wěn)定性酶的耐熱性、對(duì)變性劑、抑制劑、蛋白酶的抵抗力增加。第40頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二

可能的原因：①固定化增加了酶活性構(gòu)象的牢固程度，可防止酶分子伸展變形；②抑制酶的自身降解。③固定化部分阻擋了外界不利因素對(duì)酶的侵襲。第41頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二如：氨基酰化酶，70℃，15分鐘，酶失去活性。而固定化后，70℃，15分鐘，有>80%活性。第42頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二

（三）酶的最適溫度

最適溫度與酶穩(wěn)定性有關(guān)。多數(shù)酶固定化后熱穩(wěn)定性上升，最適溫度也上升（有例外）。

（四）酶的最適pH

帶負(fù)電荷載體：最適pH向堿性偏移。帶正電荷載體：最適pH向酸性偏移。第43頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二

固定化酶的表觀米氏常數(shù)Km隨載體的帶電性能變化。

固定化載體與底物電荷相反,固定化酶的表觀Km值降低。固定化載體與底物電荷相同,固定化酶的表觀Km值顯著增加。（五）酶的動(dòng)力學(xué)特征第44頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二與自然酶基本相同。但大分子底物難于接近酶分子，導(dǎo)致酶的專一性發(fā)生改變。（六）酶的作用專一性

第45頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二

與固定化酶相比，固定化細(xì)胞的情況比較復(fù)雜。（1）有活性升高的現(xiàn)象。（2）穩(wěn)定性的增加。（3）最適溫度和最適pH常保持不變。二、固定化細(xì)胞的性質(zhì)

第46頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二

(一)酶(細(xì)胞)的活力

固定化酶通常呈顆粒狀，一般用于測(cè)定自然酶活力的方法改進(jìn)后才能用于測(cè)定固定化酶。

(二)蛋白總量

1.雙辛可寧酸法(BCA法)2.考馬斯亮藍(lán)法

三、固定化酶（細(xì)胞）的評(píng)價(jià)指標(biāo)

第47頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二

(三)偶聯(lián)率及相對(duì)活力

偶聯(lián)率=(加入蛋白活力一上清液蛋白活力)/加入蛋白活力×100%活力回收=固定化酶總活力/加入酶的總活力×100%相對(duì)活力=固定化酶總活力/(加入酶的總活力-上清液中未偶聯(lián)酶活力)×100%第48頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二

(四)半衰期

在連續(xù)測(cè)定條件下，固定化酶(細(xì)胞)的活力下降為最初活力一半所經(jīng)歷的連續(xù)工作時(shí)間，以t1/2表示。

是衡量穩(wěn)定性的一項(xiàng)重要指標(biāo)。第49頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二乙酰-DL—AlaL—Ala+乙酸 乙酰-D—Ala第三節(jié)固定化酶與固定化細(xì)胞的應(yīng)用

一、在工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用

1.氨基?；福ˋminoacylase）世界上第一種工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶第50頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二泵儲(chǔ)罐反應(yīng)產(chǎn)物離心機(jī)消旋反應(yīng)器固定化酶柱子晶體L-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-Ala第51頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二

2.葡萄糖異構(gòu)酶世界上生產(chǎn)規(guī)模最大，應(yīng)用最為成功的一種固定化酶。第52頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二二、固定化酶在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

1.消血栓：纖溶酶是異源蛋白質(zhì)，在人體內(nèi)引起免疫反應(yīng)，無法長期使用。酶的不穩(wěn)定性使其在較短的時(shí)間內(nèi)失活。用包埋法制備的酶固定化技術(shù)可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物質(zhì)能自由進(jìn)出。第53頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二2.人工腎：原理：將病人血液中的尿素經(jīng)脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶和微膠囊活性炭組成人工腎。第54頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二第55頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二酶傳感器

固定化酶和電化學(xué)傳感器的結(jié)合。優(yōu)點(diǎn)：①既有不溶性酶體系的優(yōu)點(diǎn)，又具有電化學(xué)電極的高靈敏度；②酶的專一反應(yīng)性，使其具有較高的選擇性，能夠直接在復(fù)雜試樣中進(jìn)行測(cè)定。三、在分析檢測(cè)中的應(yīng)用第56頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二SensitiveandspecificRapidSimpleBiosensor第57頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二

1967年Updike等采用酶的固定化技術(shù)，將葡萄糖氧化酶固定在疏水膜上，然后再和氧電極結(jié)合，組裝成了世界上第一個(gè)生物傳感器——葡萄糖氧化酶電極。第58頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二葡萄糖酶電極酶電極示意圖?－D－葡萄糖＋O2 D－葡萄糖酸－1，5－內(nèi)酯＋H2O2半透膜酶膠層感應(yīng)電極第59頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二GlucoseGluconicacidGlucoseoxidaseOxygenHydrogenperoxideMembraneElectrode根據(jù)反應(yīng)中消耗的O2、生成的葡萄糖酸和H2O2的量，可以用氧電極、pH電極和H2O2電極來測(cè)定葡萄糖的含量。第60頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二繼酶傳感器（enzymesensor）后，又出現(xiàn)：細(xì)胞器傳感器（cellorganellesensor）組織傳感器（tissuesensor）微生物傳感器（microbesensor）免疫傳感器（immunosensor）第61頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二1）酶傳感器的原理生物傳感器

由生物識(shí)別單元（如酶、微生物、抗體等）和物理轉(zhuǎn)換器相結(jié)合所構(gòu)成的分析儀器。第62頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二第63頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二生物識(shí)別元件

(Biologicalrecognitionelement)是酶、抗原(體)、細(xì)胞器、組織切片和微生物細(xì)胞等生物分子經(jīng)固定化后形成的一種膜結(jié)構(gòu)，對(duì)被測(cè)定的物質(zhì)有選擇性的分子識(shí)別能力。第64頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二換能器(Transducer)將識(shí)別元件上進(jìn)行的生化反應(yīng)中消耗或生成的化學(xué)物質(zhì)，或產(chǎn)生的光或熱等轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，并呈現(xiàn)一定的比例關(guān)系。第65頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二第66頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二酶傳感器工作原理示意圖酶傳感器主要由固定化酶膜和變換器組成：固定化酶膜：選擇性地“識(shí)別”并催化被檢測(cè)物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；變換器：把催化反應(yīng)中底物或產(chǎn)物的變量轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，通過儀表顯示出來。

第67頁，共75頁，2023年，2月20日，星期二第68頁，共75頁，20