生物奧賽生化實驗第1頁/共55頁

pET3a-RecA質(zhì)粒電泳第2頁/共54頁第2頁/共55頁實驗?zāi)康谋容^質(zhì)粒載體、重組質(zhì)粒電泳時的遷移速度。第3頁/共54頁第3頁/共55頁實驗用具

錐形瓶，電泳儀，電泳槽，微波爐，微量可調(diào)移液器，DNA電泳圖譜觀察儀

第4頁/共54頁第4頁/共55頁實驗用具

第5頁/共54頁第5頁/共55頁

實驗步驟

1．取出0.4g瓊脂糖，倒入100ml的錐形瓶中，加入50ml1xTAE緩沖液，搖勻，用封口膜將瓶口封住，放在微波爐內(nèi)，至瓊脂糖完全溶解。室溫冷卻至60℃左右；問題：1、能否用蒸餾水，不用緩沖液溶解瓊脂糖？

2、瓊脂糖和瓊脂有何區(qū)別？這里能否用瓊脂代替瓊脂糖？為什么？

第6頁/共54頁第6頁/共55頁

2.在水平操作臺上，將膠槽放好，插入樣品槽梳子，倒入60℃的凝膠。待凝膠冷卻后，拔出樣品槽梳子，將凝膠連同膠槽一起放入電泳槽。加入1xTAE緩沖液，緩沖液漫過膠塊即可；問題：1、為什么手指不能觸摸凝膠？

2、電泳時，電泳緩沖液為什么要漫過瓊脂膠面？不漫過是否可行？為什么？第7頁/共54頁第7頁/共55頁3.將重組質(zhì)粒、質(zhì)粒載體中分別各加入2ul染色液和2μl加樣緩沖液，將離心管放在振蕩器上混均，再用20μl的微量移液器分別取重組質(zhì)粒20μl、質(zhì)粒載體20μl，緩慢加入凝膠上樣孔；第8頁/共54頁第8頁/共55頁4.加樣完畢，蓋上電泳槽，接好電源，調(diào)節(jié)電壓至100V，開始電泳，當(dāng)樣品中溴酚藍(lán)條帶移動到凝膠前沿即可停止電泳；

問題：DNA電泳時，DNA是向正極還是向負(fù)極泳動？為什么？

5.觀察電泳結(jié)果：電泳結(jié)束后，將電泳槽移至DNA圖譜觀察儀中，打開光源，在觀察窗上觀看電泳結(jié)果；6．記錄：將觀察結(jié)果依比例劃在圖1中。第9頁/共54頁第9頁/共55頁

實驗結(jié)果與分析

圖1.質(zhì)粒電泳圖譜，1為質(zhì)粒載體，2為重組質(zhì)粒根據(jù)質(zhì)粒的電泳圖譜，可以看出重組質(zhì)粒在凝膠中的遷移速度

質(zhì)粒載體，這是由于重組質(zhì)粒中除了質(zhì)粒載體，還整合有

，所以分子量大于質(zhì)粒載體，在電場中的遷移速度較

。第10頁/共54頁第10頁/共55頁

圖譜上的質(zhì)粒共有3條帶，分別代表質(zhì)粒的3種狀態(tài)，遷移最快的是

狀態(tài)的質(zhì)粒，較慢的是

的質(zhì)粒，最慢的是質(zhì)粒

。第11頁/共54頁第11頁/共55頁圖1.質(zhì)粒電泳圖譜，1為質(zhì)粒載體，2為重組質(zhì)粒圖1是質(zhì)粒的電泳圖譜，可以看出重組質(zhì)粒在凝膠中的遷移速度慢于質(zhì)粒載體，這是由于重組質(zhì)粒中除了質(zhì)粒載體，還整合有外源片段，所以分子量大于質(zhì)粒載體，在電場中的遷移速度較慢。第12頁/共54頁第12頁/共55頁圖譜上的質(zhì)粒共有3條帶，分別代表質(zhì)粒的3種狀態(tài)，遷移最快的是超螺旋狀態(tài)的質(zhì)粒，較慢的是線性的質(zhì)粒，最慢的是質(zhì)粒開環(huán)。第13頁/共54頁第13頁/共55頁1．DNA電泳時，DNA是向正極還是向負(fù)極泳動？為什么？答：正極。因為DNA是由脫氧核糖核苷酸通過磷酸酯鍵連接而成.DNA所帶的電荷是由磷酸根帶負(fù)電引起的,所以應(yīng)該向正極移動.2．為什么手指不能觸摸凝膠？答：因為手指上的汗液含有蛋白、脂類等成份。這些成份會影響各樣品槽中樣品DNA的移動速度，從而嚴(yán)重影響凝膠條帶的觀察效果。第14頁/共54頁第14頁/共55頁3．能否用蒸餾水，不用緩沖液溶解瓊脂糖？答：蒸餾水溶解形成的凝膠,無法通過電流,不能使泳帶分開和移動。4．瓊脂糖和瓊脂有何區(qū)別？這里能否用瓊脂代替瓊脂糖？為什么？答：瓊脂由瓊脂糖（Agarose）和瓊脂果膠（Agaropectin）兩部分組成，瓊脂糖是不含硫酸酯的非離子型多糖，是形成凝膠的組分，而瓊脂果膠是非凝膠部分，是帶有硫酸酯、葡萄糖醛酸和丙酮酸醛的復(fù)雜多糖。不能用瓊脂代替瓊脂糖，瓊脂中含有的復(fù)雜多糖成分會干擾電泳結(jié)果，還會造成較亮的背景。第15頁/共54頁第15頁/共55頁5．電泳時，電泳緩沖液為什么要漫過瓊脂膠面？不漫過是否可行？為什么？答：電泳緩沖液漫過凝膠膠面可以使膠孔中的樣品受到相同的電場力，不漫過瓊脂膠面不可行，這樣會干擾電泳結(jié)果。第16頁/共54頁第16頁/共55頁牛奶中的蛋白

第17頁/共54頁第17頁/共55頁實驗?zāi)康牧私馊纫宜幔═CA）沉淀蛋白的特點(diǎn)，以及牛奶蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測定第18頁/共54頁第18頁/共55頁

實驗步驟—實驗Ⅰ

1．取兩支試管（1）和（2），各加入2ml奶粉溶液，在（1）號試管中再加入5滴三氯乙酸溶液，混勻后再加入0.5ml蛋白酶液，這一試管作為對照。在（2）號試管中，加入0.5ml蛋白酶液，震蕩均勻后兩試管靜置30分鐘。

問題：1、胰蛋白酶水解蛋白的產(chǎn)物是氨基酸，還是多肽？是內(nèi)切酶還是外切酶？在胰臟中是否有胰蛋白酶活性？

2、三氯乙酸在這里起什么作用？2.30分鐘后，再向（2）號管中加入5滴三氯乙酸溶液，混勻，再靜置10分鐘。第19頁/共54頁第19頁/共55頁

3.分別吸取（1）和（2）號管中的上清液1ml4000r/min離心5min，取上清0.5ml分別加入兩個試管中。4.各加入3滴雙縮脲試劑，觀察并記錄顏色變化，將實驗結(jié)果填入表1。

問題：雙縮脲試劑與上述清液反應(yīng)后變色，雙縮脲試劑測定的是什么？生成的產(chǎn)物是什么物質(zhì)？

第20頁/共54頁第20頁/共55頁實驗步驟—實驗Ⅱ1.在一個50ml三角瓶中加入5ml奶粉溶液，向奶粉溶液中加入4ml鹽酸溶液，混合均勻后靜置30秒觀察記錄現(xiàn)象，測定pH。2.在上述溶液中再加入4ml鹽酸溶液，振蕩均勻，靜置30秒觀察并記錄現(xiàn)象，測定pH。第21頁/共54頁第21頁/共55頁3.在上述溶液中再加入2ml氫氧化鈉溶液，振蕩均勻，靜置30秒觀察并記錄現(xiàn)象，測定pH。4.在上述溶液中再加入2ml氫氧化鈉溶液，振蕩均勻，靜置30秒觀察并記錄現(xiàn)象，測定pH，將實驗結(jié)果填入表2。第22頁/共54頁第22頁/共55頁

實驗結(jié)果與分析

表1加入雙縮脲試劑前后顏色變化

21第23頁/共54頁第23頁/共55頁

實驗結(jié)果與分析

管號加入前加入后對照（1）號樣品（2）號

實驗Ⅰ

表1加入雙縮脲試劑前后顏色變化無色透明無色透明淡藍(lán)色紫色第24頁/共54頁第24頁/共55頁

實驗結(jié)果與分析

實驗Ⅰ：如圖1所示，牛奶中的蛋白經(jīng)過三氯乙酸沉淀后,加入胰蛋白酶所得到的上清液中蛋白(包括胰蛋白酶)

,上清液中多肽或蛋白含量

,從而有弱的顏色反應(yīng)變化；牛奶中蛋白先與胰蛋白酶反應(yīng)，得到

，再加入三氯乙酸沉淀蛋白后，取其上清液與雙縮脲試劑反應(yīng)，呈顯

，顏色變化明顯，說明上清液中含有

，三氯乙酸能夠沉淀

但不沉淀

。變性沉淀很少多肽紫色多肽蛋白多肽第25頁/共54頁第25頁/共55頁

處理現(xiàn)象pH值第一次加酸無明顯變化第二次加酸明顯有沉淀第一次加堿沉淀完全溶解第二次加堿無明顯變化

實驗Ⅱ

表2蛋白溶液酸堿變化的現(xiàn)象觀察6.05.06.07.0第26頁/共54頁第26頁/共55頁可以看出牛奶在pH5.0時發(fā)生

，改變?nèi)芤旱?/p>

，沉淀能夠重新溶解，說明牛奶中主要的蛋白的等電點(diǎn)在pH5.0左右。沉淀pH值問題：1、牛奶中主要蛋白是什么蛋白？2、什么方法可測定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)？

第27頁/共54頁第27頁/共55頁酵母糖酵解實驗

第28頁/共54頁第28頁/共55頁實驗?zāi)康牧私饨湍柑墙徒獾姆磻?yīng)原理以及還原糖的特性。第29頁/共54頁第29頁/共55頁實驗步驟1．將兩份0.25gBa（OH）2分別轉(zhuǎn)移至兩100ml三角瓶中，各加入10ml蒸餾水，配制Ba（OH）2溶液，再用一次性手套將瓶口封住，分別標(biāo)記為實驗和對照。2.再將0.285g的草酸轉(zhuǎn)移至另外的100ml三角瓶中，加入100ml蒸餾水，配制草酸溶液。第30頁/共54頁第30頁/共55頁

3.

將0.28g葡萄糖倒入50mL燒杯中，加入10ml蒸餾水溶解，制成葡萄糖溶液。4.

取5mL葡萄糖溶液倒入酵母反應(yīng)管中。再將0.25g的干酵母粉倒入酵母反應(yīng)管中與葡萄糖溶液混勻，將酵母反應(yīng)管放入裝有Ba（OH）2的三角瓶中，封好三角瓶，在恒溫培養(yǎng)箱中32℃靜置反應(yīng)。另一三角瓶不加酵母反應(yīng)瓶，作為空白對照。問題：你知道食用酵母是用什么培養(yǎng)出來的嗎？第31頁/共54頁第31頁/共55頁

反應(yīng)1小時后，從三角瓶中取出酵母反應(yīng)管，再將三角瓶口封好。問題：1、釋放的CO2來自什么物質(zhì)？2、有氧存在時能進(jìn)行糖酵解嗎？取兩支試管，各加入糖試劑2ml，將酵母反應(yīng)管中的懸液取出1.5ml，加入離心管中4000轉(zhuǎn)/分離心4分鐘，將上清液0.5ml加到一支裝有糖試劑的試管中，同時取葡萄糖溶液0.5ml加到另一含有糖試劑的試管中為對照，在試管上標(biāo)記清楚。80℃水浴中加熱3分鐘，觀察顏色變化。問題：1、本實驗?zāi)芊裼谜崽谴嫫咸烟牵?、

我們食用的蔗糖都來自什么植物的什么部分？第32頁/共54頁第32頁/共55頁將草酸溶液加到酸性滴定管中，兩個三角瓶在滴定前各加入1滴酚酞指示劑，在搖動中不停地滴入草酸溶液，直到三角瓶中溶液的紅色褪去，計算酵母糖酵解瓶滴入的草酸溶液的毫升數(shù)(V1)。問題：指示劑除指示酸堿變化外，還有什么樣的指示劑？以未進(jìn)行糖酵解反應(yīng)的、內(nèi)含10ml飽和Ba(OH)2溶液的三角瓶為對照，計算沒有吸收CO2時滴入的草酸溶液的毫升數(shù)(V0)，V0-V1即為糖酵解時釋放出的CO2毫克數(shù)(1毫升草酸溶液相當(dāng)于1毫克CO2)。第33頁/共54頁第33頁/共55頁

實驗結(jié)果與分析

樣品滴定用草酸量生成CO2量實驗（V1）20mL對照（V0）30mL

滴定結(jié)果：

V0-V1=10mg第34頁/共54頁第34頁/共55頁

實驗結(jié)果與分析

1糖試劑對照；2對照組；3實驗組

123

滴定結(jié)果：

第35頁/共54頁第35頁/共55頁濾紙崩潰法測定纖維素酶活力

第36頁/共54頁第36頁/共55頁實驗原理濾紙是由纖維素構(gòu)成的，纖維素是由β-葡萄糖分子以1，4糖苷鍵連接而成。纖維素酶廣泛存在于微生物中，特別是真菌微生物。纖維素酶可水解β-1，4糖苷鍵，從而使纖維素組成的纖維斷裂，但一定酶濃度下的作用速度與溫度和pH有關(guān)。濾紙片在加入纖維素酶溶液后自濾紙邊緣逐漸破壞，最后全部崩解。酶活力可用每毫升酶液使1平方厘米紙完全消失所用時間（分鐘）的倒數(shù)來表示。第37頁/共54頁第37頁/共55頁實驗步驟1.取50毫升三角瓶四支，標(biāo)上記號，①號瓶中加入1毫升緩沖液（pH4.6）和1毫升水，再加入0.5毫升水；②號瓶中加入1毫升緩沖液（pH8.0）和1毫升水，再加入0.5毫升水；③號瓶中加入1毫升緩沖液（pH4.6）和1毫升水，再加入0.5毫升酶液；④號瓶中加入1毫升緩沖液（pH8.0）和1毫升水，再加入0.5毫升酶液。第38頁/共54頁第38頁/共55頁

在室溫下，向三角瓶中各加入1平方厘米濾紙1片浸到溶液中，并開始計時，手動振蕩，觀察并記錄濾紙完全崩潰所用的時間，計算酶活力。第39頁/共54頁第39頁/共55頁

實驗結(jié)果（60分鐘）①號瓶②號瓶③號瓶④號瓶第40頁/共54頁第40頁/共55頁

80分鐘①號瓶②號瓶③號瓶④號瓶第41頁/共54頁第41頁/共55頁

1.在pH4.6時，還是pH8.0時纖維素酶的活性最高？2.估計在30℃時，還是45℃時酶的活力高？答：在45℃時此酶的活力高于30℃。溫度對酶的反應(yīng)速度有很大影響，動物組織中的酶最適溫度在35℃到40℃之間，而植物中的酶在40℃至50℃之間。3.酶存放在4℃，還是45℃下能保持較長時間不失活？

4.木材造紙時，用堿（NaOH）水解并去除木質(zhì)素和半纖維素，為什么不用酸水解呢？第42頁/共54頁第42頁/共55頁

5.好的紙張長久保存仍為白色，而報紙為什么時間長了變黃色呢？答：因此報紙在制造過程中，沒有完全除去木質(zhì)素，木質(zhì)素是酚類聚合物，可被氧化成醌，而變黃。第43頁/共54頁第43頁/共55頁P(yáng)CR—性別鑒定

第44頁/共54頁第44頁/共55頁實驗?zāi)康耐ㄟ^PCR技術(shù)鑒定人類性別，DYZ1基因是Y染色體長臂異染色區(qū)的特異重復(fù)序列，是男性特有的基因。第45頁/共54頁第45頁/共55頁實驗步驟1、分別拔取甲、乙、丙、丁4個人的3根帶有毛囊的頭發(fā)，然后剪下毛囊，放進(jìn)0.5mL離心管中，做好標(biāo)記2、在加有毛囊的0.5mL離心管中分別加入下列成份：ddH2O13μL、10Xbuffer2μL、MgCl22μL、dNTPmixture0.8μL、引物Ⅰ1μL、引物Ⅱ1μL、TaqDNA聚合酶（5u/μL）0.2μL總體積20μL第46頁/共54頁第46頁/共55頁

3、設(shè)定反應(yīng)程序：預(yù)變性：94℃200s變性：94℃30s退火：52℃20s延伸：72℃30s保溫：72℃200s循環(huán)次數(shù)25次

4、瓊脂糖凝膠電泳第47頁/共54頁第47頁/共55頁

實驗結(jié)果與分析

圖1M：D2000marker；1：甲擴(kuò)增結(jié)果；2：乙擴(kuò)增結(jié)果；3：丙擴(kuò)增結(jié)果；4：丁擴(kuò)增結(jié)果；第48頁/共54頁第48頁/共55頁微生物的分離技術(shù)

第49頁/共54頁第49頁/共55頁實驗?zāi)康膹囊蝗何⑸镏蟹蛛x出一種或一類微生物第50頁/共54頁第50頁/共55頁實驗步驟—稀釋涂布第51頁/共54頁第51頁/共55頁實驗步驟—劃線分離連續(xù)劃線法交叉劃線法第52頁/共54頁第52頁/共55頁ThankYou!第53頁/共54頁第53頁/共55頁；/info-8874/龍王傳說hxh03kyd也算了，如何反幫她？幫她，為何還要偷偷的？可太便宜她了！”明秀笑道：“雖然不害她，實在卻是在幫你?！备ｇ笥犅暤溃骸叭绾问菐土宋?？”明秀頗有些恨鐵不成鋼的樣子，問道：“你說她買這些花，是做什么呢？”“席上添香?。　备ｇ蟮?，“一團(tuán)團(tuán)茉莉添香，多么雅致，從沒見人擺過，難得她怎么想得出來?！泵餍阊凵癫⒉徽J(rèn)同，福珞聲音越說越低，轉(zhuǎn)念一想，忽想通了：“哎呀！吃這頓飯，又是大魚、又是大肉的，各種大菜香味，跟清雅花香一沖混，南轅北轍，怎生尷尬？原來不是前人放著這好主意不想，卻是本不該用的！吃大菜，席上本不能近著人用茉莉、丁香、龍涎之屬。”“你總