生物技術(shù)與人類生活蛋白質(zhì)工程第1頁/共41頁8-02蛋白質(zhì)工程8-02.1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)8-02.1.1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本構(gòu)件

蛋白質(zhì)、核酸、多糖和脂類等生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能。蛋白質(zhì)工程第2頁/共41頁8-02.1.1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本構(gòu)建8-02.1.1.1蛋白質(zhì)的化學(xué)組成基本元素:

有機(jī)元素:碳、氫、氧和氮無機(jī)元素:堿金屬、堿土金屬和重金屬

蛋白質(zhì):、胨、肽氨基酸分類:

非極性R基氨基酸、不帶電荷的極性R基氨基酸、帶正電荷的R

基氨基酸、帶負(fù)電荷的R基酸性氨基酸

蛋白質(zhì)工程第3頁/共41頁8-02.1.1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本構(gòu)建8-02.1.1.2氨基酸的物理性質(zhì)

無色結(jié)晶特殊晶型溶點(diǎn)極高兩性離子形式存在氨基和羧基接受質(zhì)子和釋放質(zhì)子

兩性電解質(zhì)蛋白質(zhì)工程第4頁/共41頁

8-02.1.1.3蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)各種氨基酸的簡寫符號(hào)

名稱三字母符號(hào)單字母符號(hào)名稱三字母符號(hào)單字母符號(hào)丙氨酸AlaA異亮氨酸IleI精氨酸ArgR亮氨酸LeuL天冬酰胺AsnN賴氨酸LysK天冬氨酸AspD蛋氨酸MetMAsn或AspAsxB苯丙氨酸PheF半胱氨酸CysC脯氨酸ProP谷氨酰胺GlnQ絲氨酸SerS谷氨酸GluE蘇氨酸ThrTGln或GluGlxZ色氨酸TrpW甘氨酸GlyG酪氨酸TyrY組氨酸HisH纈氨酸ValV8-02.1.1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本構(gòu)建蛋白質(zhì)工程第5頁/共41頁8-02.1.1.3蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)多肽鏈

:由許多氨基酸按一定的排列順序通過肽鍵相連而成。酰胺鍵

:一個(gè)氨基酸的氨基與另一氨基酸的羧基縮合失去一分子水。

肽鍵結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)工程第6頁/共41頁8-02.1.1.3蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)XYZ

人ThrThrIle

豬AlaThrIle

牛AlaAlaVal

圖6-2豬、牛和人的胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)工程第7頁/共41頁8-02.1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)6-02.1.2蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)分子結(jié)構(gòu):

一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)。分子構(gòu)象:

空間結(jié)構(gòu)、高級(jí)結(jié)構(gòu)、立體結(jié)構(gòu)、三維結(jié)構(gòu)。二級(jí)結(jié)構(gòu)

:指多肽鏈主鏈骨架中的若干肽段，各自沿著某個(gè)軸盤旋或折疊，并以氫鍵維系，從而形成有規(guī)則的構(gòu)象。

α螺旋、β折疊和β轉(zhuǎn)角蛋白質(zhì)工程第8頁/共41頁8-02.1.2蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)α螺旋結(jié)構(gòu)

β折疊結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)工程

第9頁/共41頁8-02.1.2蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu):在三維空間中沿著多方向進(jìn)行卷曲、折疊、盤繞而成的近似球形的結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)構(gòu)象作用力:R基之間的氫鍵非極性R基之間的疏水基相互作用α螺旋和β折疊中的肽鏈內(nèi)或肽鏈間的氫鍵帶正負(fù)電荷的R基之間的離子鍵蛋白質(zhì)工程

第10頁/共41頁8-02.1.2蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)亞基(三級(jí)結(jié)構(gòu))

一條多肽鏈組成。數(shù)條多肽鏈組成，這些多肽鏈通常以二硫鍵相連接成為亞基。四級(jí)結(jié)構(gòu)亞基聚合而成亞基之間非共價(jià)鍵結(jié)合均一四級(jí)結(jié)構(gòu)非均一四級(jí)結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)工程第11頁/共41頁8-02.1.2蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)維持四級(jí)結(jié)構(gòu)的主要力:

疏水鍵、氫鍵、離子鍵和范德華引力

常見的聚合體:

二聚體、三聚體、四聚體、五聚體，最多可聚合成六十聚體

蛋白質(zhì)工程第12頁/共41頁8-02.1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)8-02.1.3蛋白質(zhì)分子之間的相互作用

蛋白質(zhì)工程第13頁/共41頁8-02.1.3蛋白質(zhì)分子之間的相互作用鉬鐵蛋白和鐵蛋白相互作用示意圖(引自Schlessmanetal.)鐵蛋白鉬鐵蛋白蛋白質(zhì)工程第14頁/共41頁8-02.1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)8-02.1.4蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)必須具備特定的結(jié)構(gòu)，才能表現(xiàn)特定的功能，在蛋白質(zhì)肽鏈中有一些基團(tuán)對(duì)特定功能而言是必需基團(tuán)，另一些是非必需基團(tuán)。在體內(nèi)，蛋白質(zhì)分子是如何利用它的特定結(jié)構(gòu)執(zhí)行特定的生物功能的。

蛋白質(zhì)工程第15頁/共41頁8-02.1.4蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系同源蛋白質(zhì)指在不同的有機(jī)體中實(shí)現(xiàn)同一功能的蛋白質(zhì)，但這些同源蛋白質(zhì)中的氨基酸序列存在著種屬的差異性。

結(jié)構(gòu)域

多肽鏈之間以共價(jià)鍵方式連接功能區(qū)域

蛋白質(zhì)工程第16頁/共41頁8-02.1.4蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

鐵蛋白的分子結(jié)構(gòu)是由鐵核和蛋白質(zhì)殼組成的。

鐵蛋白的隧道可分為電子隧道和物質(zhì)交換隧道，前者起著傳遞電子的作用，后者起著物質(zhì)交換的通道作用。

鐵蛋白蛋白質(zhì)殼通過柔性調(diào)節(jié)產(chǎn)生電子傳遞現(xiàn)象。蛋白質(zhì)工程第17頁/共41頁8-02.1.4蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

鐵蛋白分子結(jié)構(gòu)圖

A：蛋白質(zhì)殼；B：鐵核；C：三相物質(zhì)交換隧道

A蛋白質(zhì)工程第18頁/共41頁8-02.1.4蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系proteaseinhibitor-proteasecomplexinhibitor

絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serpins)抑制蛋白酶活性的途徑與機(jī)理蛋白質(zhì)工程第19頁/共41頁8-02.1.4蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

模擬核小體分子

蛋白質(zhì)工程第20頁/共41頁8-02蛋白質(zhì)工程8-02.2蛋白質(zhì)工程的研究方法8-02.2.1蛋白質(zhì)工程的研究策略

蛋白質(zhì)工程的基本途徑：從預(yù)期功能出發(fā)，設(shè)計(jì)期望的結(jié)構(gòu)，合成目的基因且有效克隆表達(dá)或通過誘變、定向修飾和改造等一系列工序，合成新型優(yōu)良蛋白質(zhì)。

蛋白質(zhì)工程第21頁/共41頁8-02.2.1蛋白質(zhì)工程的研究策略

蛋白質(zhì)工程的主要研究手段:

利用所謂的反向生物學(xué)技術(shù)，其基本思路是按期望的結(jié)構(gòu)尋找最適合的氨基酸序列，通過計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)，進(jìn)而模擬特定的氨基酸序列在細(xì)胞內(nèi)或在體內(nèi)環(huán)境中進(jìn)行多肽折疊而成三維結(jié)構(gòu)的全過程，并預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和表達(dá)出生物學(xué)功能的可能及其高低程度。

蛋白質(zhì)工程第22頁/共41頁8-02.2.1蛋白質(zhì)工程的研究策略蛋白質(zhì)工程第23頁/共41頁8-02.2蛋白質(zhì)工程的研究方法8-02.2.2蛋白質(zhì)的全新設(shè)計(jì)8-02.2.2.1設(shè)計(jì)目標(biāo)的選擇蛋白質(zhì)全新設(shè)計(jì)功能設(shè)計(jì)、結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)。研究重點(diǎn)和難點(diǎn)從結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)出發(fā)，從蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)開始，以摸索蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)工程第24頁/共41頁8-02.2.2蛋白質(zhì)的全新設(shè)計(jì)8-02.2.2.2蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)技術(shù)與方法

常用的蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)思路

是否存在蛋白質(zhì)多聚體狀態(tài)；二級(jí)結(jié)構(gòu)與預(yù)期目標(biāo)是否吻合。

是否具有預(yù)定的三級(jí)結(jié)構(gòu)。圓二色譜和核磁共振技術(shù)可用于研究蛋白質(zhì)。

是否以單分子或多聚體形式存在。三級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定目前主要依靠熒光和核磁共振技術(shù)。體積排阻色譜法也可以用于判斷分子體積大小、聚合體數(shù)目和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是處于無規(guī)則狀態(tài)或三級(jí)結(jié)構(gòu)等生化參數(shù)。蛋白質(zhì)工程第25頁/共41頁8-02.2.2蛋白質(zhì)的全新設(shè)計(jì)

天然的鋅指多肽FSD-1多肽(從頭設(shè)計(jì))蛋白質(zhì)工程第26頁/共41頁8-02.2蛋白質(zhì)工程的研究方法8-02.2.3改變現(xiàn)有蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分離純化目標(biāo)蛋白質(zhì)。分析目標(biāo)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)；分析目標(biāo)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)以及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。根據(jù)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)引物，克隆目的基因。根據(jù)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以及蛋白質(zhì)改造的目的設(shè)計(jì)改造方案。對(duì)目的基因進(jìn)行人工定點(diǎn)突變。改造后的基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)。分離純化表達(dá)的蛋白質(zhì)并分析其功能，評(píng)價(jià)是否達(dá)到設(shè)計(jì)目的。蛋白質(zhì)工程第27頁/共41頁8-02.2.3改變現(xiàn)有蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)

改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的核心技術(shù)

基因人工定點(diǎn)突變技術(shù)M13載體法PCR擴(kuò)增法蛋白質(zhì)工程第28頁/共41頁8-02.2.3改變現(xiàn)有蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)8-02.2.3.1M13載體法該法的原理是利用人工合成帶突變位點(diǎn)的寡聚核苷酸作為引物，利用M13噬菌體載體系統(tǒng)合成突變基因。蛋白質(zhì)工程第29頁/共41頁8-02.2.3.1M13載體法

M13載體法基因人工定點(diǎn)突變示意圖（引自吳乃虎，1998）蛋白質(zhì)工程第30頁/共41頁8-02.2.3.2ＰＣＲ擴(kuò)增法

該法的原理也是利用人工合成帶突變位點(diǎn)的誘變引物，通過ＰＣＲ擴(kuò)增而獲得定點(diǎn)突變的基因。PCR定點(diǎn)誘變法可分為重組PCR定點(diǎn)誘變法和大引物誘變法兩種。

蛋白質(zhì)工程8-02.2.3改變蛋白質(zhì)的現(xiàn)有結(jié)構(gòu)第31頁/共41頁

重組PCR定點(diǎn)突變法示意圖（引自吳乃虎，1998）

蛋白質(zhì)工程8-02.2.3.2PCR擴(kuò)增法第32頁/共41頁

大引物誘變法示意圖（引自吳乃虎，1998）

蛋白質(zhì)工程8-02.2.3.2PCR擴(kuò)增法第33頁/共41頁8-02蛋白質(zhì)工程

8-02.3蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用實(shí)例

8-02.3.1胰蛋白酶

223個(gè)氨基酸殘基和以異亮氨酸為N端的單肽鏈。

Arg117位自溶點(diǎn)的缺失突變，得到缺失突變體，其結(jié)果表明該突變體的穩(wěn)定性明顯提高。將酶分子表面的正電荷改變成負(fù)電荷，以提高胰蛋白酶催化活性中心His57的pKa值，在pH較高的條件下顯示出對(duì)精氨酸具有更高的專一性。蛋白質(zhì)工程第34頁/共41頁8-02.3蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用實(shí)例

8-02.3.2人白細(xì)胞介素-2

由133個(gè)氨基酸殘基組成，共有三個(gè)半胱氨酸。二硫鍵的錯(cuò)誤配對(duì)將降低其生物學(xué)活性并對(duì)人具有抗原性。用基因定點(diǎn)突變方法可將IL-2的125位Cys改為絲氨酸（Ser）或丙氨酸（Ala），避免錯(cuò)誤配對(duì)的產(chǎn)生，而且其熱穩(wěn)定性等方面也有較明顯的改善。蛋白質(zhì)工程第35頁/共41頁8-02.4蛋白質(zhì)組學(xué)

針對(duì)有關(guān)基因或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的生物體或組織/細(xì)胞，建立其蛋白質(zhì)組或亞蛋白質(zhì)組及其蛋白質(zhì)組連鎖群，即組成性蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

以重要生命過程或人類重大疾病為對(duì)象，進(jìn)行重要的生理/病理體系或過程的局部蛋白質(zhì)研究，即比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究

。

蛋白質(zhì)組學(xué)支撐技術(shù)平臺(tái)或生物信息學(xué)研究。8-02蛋白質(zhì)工程蛋白質(zhì)工程第36頁/共41頁8-02.4蛋白質(zhì)組學(xué)

部分醫(yī)學(xué)科學(xué)重點(diǎn)研究領(lǐng)域

研究細(xì)胞的增殖、分化、異常轉(zhuǎn)化、腫瘤形成等方面，涉及白血病、乳腺癌、結(jié)腸癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤等重大疾病。

蛋白質(zhì)工程第37頁/共41頁目前國內(nèi)研究進(jìn)展

重大疾病（如肝癌）、維甲酸誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡啟動(dòng)模型。維甲酸定向誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)系統(tǒng)分化的蛋白質(zhì)組。血清中篩選診斷重大疾病的標(biāo)志物——人血清蛋白質(zhì)組學(xué)。各類腫瘤疾病形成過程中,參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道的蛋白質(zhì)組。