生物步步高二輪基因工程和細(xì)胞工程第1頁(yè)/共63頁(yè)（2）DNA連接酶——“分子縫合針”：把兩條DNA

之間的縫隙“縫合”起來(lái)末端（3）載體——“分子運(yùn)輸車”常用載體：

載體條件質(zhì)粒在宿主細(xì)胞內(nèi)

并能

有多個(gè)限制酶切點(diǎn)有

，便于

對(duì)宿主細(xì)胞無(wú)害穩(wěn)定存在復(fù)制標(biāo)記基因篩選2.基本操作程序獲取目的基因：常用方法從基因文庫(kù)中獲取利用

技術(shù)擴(kuò)增人工合成法PCR第2頁(yè)/共63頁(yè)↓↓導(dǎo)入受體細(xì)胞：常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法

花粉管通道法顯微注射法

的檢測(cè)與鑒定目的基因檢測(cè)鑒定：有些需要進(jìn)行

水平的鑒定受體細(xì)胞是否具有某些

目的基因是否翻譯成

個(gè)體生物學(xué)標(biāo)記基因蛋白質(zhì)↓表達(dá)載體構(gòu)建

第3頁(yè)/共63頁(yè)轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基因藥物基因治療3.應(yīng)用抗蟲(chóng)、抗病、抗逆改良植物品質(zhì)提高動(dòng)物生長(zhǎng)速度改善畜產(chǎn)品質(zhì)量、作

移植的供體器官第4頁(yè)/共63頁(yè)二、細(xì)胞工程1.細(xì)胞全能性（1）概念：具有某種生物

遺傳信息的細(xì)胞，都具有發(fā)育成完整生物體的潛能（2）潛能大小：受精卵>生殖細(xì)胞>體細(xì)胞全部2.植物組織培養(yǎng)（1）過(guò)程：（2）應(yīng)用快速繁殖脫毒植株人工種子第5頁(yè)/共63頁(yè)3.第6頁(yè)/共63頁(yè)4.細(xì)胞核移植過(guò)程：應(yīng)用：快速培育優(yōu)良家畜生產(chǎn)醫(yī)用蛋白提供

移植的供體器官異種第7頁(yè)/共63頁(yè)考點(diǎn)一基因工程的具體操作流程和應(yīng)用1.理解基因工程的工具（1）工具酶①限制性核酸內(nèi)切酶：只能在特定的部位進(jìn)行切割，切割位點(diǎn)一般具有反向重復(fù)序列。作用結(jié)果：形成黏性末端或平末端。作用實(shí)質(zhì)：使特定部位的兩核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。②DNA連接酶作用實(shí)質(zhì)：兩類DNA連接酶都是將雙鏈DNA片段“縫合”起來(lái)，恢復(fù)被限制酶切開(kāi)了的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。第8頁(yè)/共63頁(yè)（2）載體①種類：常用的載體是質(zhì)粒，大腸桿菌、枯草桿菌、 土壤農(nóng)桿菌等細(xì)菌中都有質(zhì)粒。②作為載體應(yīng)具備的條件

a.對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害，不影響受體細(xì)胞正常的生命活動(dòng)。

b.具有標(biāo)記基因，以便于鑒定目的基因是否進(jìn)入受體 細(xì)胞。

c.能自我復(fù)制，通過(guò)復(fù)制進(jìn)行基因擴(kuò)增，否則可能會(huì) 使重組DNA丟失。

d.具有一個(gè)至多個(gè)酶切位點(diǎn)，以便于目的基因的插入。

e.載體DNA分子大小適合，以方便操作。2.基因工程的一般步驟（1）獲取目的基因獲取途徑：基因文庫(kù)、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因等。第9頁(yè)/共63頁(yè)（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建①用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)有黏性末端或平末端的切口。②用同種限制酶切割目的基因，產(chǎn)生相同的黏性末端或平末端。③用DNA連接酶將質(zhì)粒與目的基因重新連接形成重組質(zhì)粒。（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞受體種類植物動(dòng)物微生物導(dǎo)入方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法顯微注射法感受態(tài)細(xì)胞法第10頁(yè)/共63頁(yè)（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定類型步驟檢測(cè)內(nèi)容方法結(jié)果顯示分子水平檢測(cè)第一步轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入目的基因DNA分子雜交（DNA和DNA之間）是否成功顯示出雜交帶第二步目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA分子雜交（mRNA和DNA之間）是否成功顯示出雜交帶第三步目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)抗原—抗體雜交是否成功顯示出雜交帶個(gè)體水平檢測(cè)包括抗蟲(chóng)、抗病的接種實(shí)驗(yàn)，以確定是否具有抗性以及抗性的程度；基因工程產(chǎn)品需要與天然產(chǎn)品的活性比較，以確定功能活性是否相同等第11頁(yè)/共63頁(yè)特別提醒目的基因的檢測(cè)也可利用質(zhì)粒中的標(biāo)記基因，如大腸桿菌質(zhì)粒中含抗青霉素基因，把某種轉(zhuǎn)基因生物放入帶有青霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。若有抗性，說(shuō)明導(dǎo)入成功；若無(wú)抗性，說(shuō)明導(dǎo)入失敗。第12頁(yè)/共63頁(yè)

我國(guó)科研人員發(fā)現(xiàn)，彎曲的蠶絲由于彎折處易斷裂，其強(qiáng)度低于由蜘蛛紡績(jī)器拖牽絲的直絲，并首次在世界上通過(guò)了轉(zhuǎn)基因方法將“綠色熒光蛋白基因”與“蜘蛛拖牽絲基因”拼接后成功插入蠶絲基因組中，并在受體細(xì)胞中成功表達(dá)。第13頁(yè)/共63頁(yè)（1）在這項(xiàng)“基因工程”的操作中，目的基因是

，采用綠色熒光蛋白基因的主要目的是

。（2）兩基因組合在導(dǎo)入受體細(xì)胞前必須進(jìn)行的步驟是：將其與由細(xì)菌體內(nèi)取得的

進(jìn)行切割處理，以保證有相同的

，并拼接成

。如果引入的受體細(xì)胞是細(xì)菌，還要對(duì)細(xì)菌作

處理。（3）在基因工程中受體常用微生物，為什么？

。（4）“蜘蛛拖牽絲基因”成功表達(dá)的標(biāo)志是

。（5）帶有“綠色熒光蛋白基因”的轉(zhuǎn)基因蠶，是否能引起生態(tài)安全性問(wèn)題？請(qǐng)分析原因。

。第14頁(yè)/共63頁(yè)解析從題目提供的信息不難看出，蜘蛛紡績(jī)器拖牽絲的直絲強(qiáng)度比蠶絲要大，所以拖牽絲基因是目的基因，綠色熒光蛋白基因是作為標(biāo)記基因。在形成重組DNA時(shí)，首先要用同一種限制性內(nèi)切酶切割目的基因和質(zhì)粒，得到相同的黏性末端，再用DNA連接酶形成重組質(zhì)粒，如果要將重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌體內(nèi)，必須對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁用氯化鈣處理，增加其通透性，便于重組質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)。蜘蛛拖牽絲基因成功表達(dá)時(shí)，能產(chǎn)生高強(qiáng)度的絲，轉(zhuǎn)基因生物的安全性問(wèn)題正在探索中。第15頁(yè)/共63頁(yè)答案（1）拖牽絲基因作為標(biāo)記（基因）（2）質(zhì)粒黏性末端重組質(zhì)粒（或重組DNA）CaCl2（或提高膜的通透性）（3）微生物的繁殖速度快（4）產(chǎn)生高強(qiáng)度的絲（5）可能。轉(zhuǎn)基因蠶擴(kuò)散進(jìn)入自然生態(tài)系統(tǒng)，與同種的野生蠶雜交后，使野生蠶也含有轉(zhuǎn)基因，可能會(huì)威脅到原有物種，引起生態(tài)危機(jī)第16頁(yè)/共63頁(yè)

（08·廣東卷）天然釀酒酵母菌通常缺乏分解淀粉的酶類，用作發(fā)酵原料的淀粉需經(jīng)一系列復(fù)雜的轉(zhuǎn)化過(guò)程才能被利用。研究者從某絲狀真菌中獲取淀粉酶基因并轉(zhuǎn)入釀酒酵母菌，獲得的釀酒酵母工程菌可直接利用淀粉產(chǎn)生酒精。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：（1）將淀粉酶基因切割下來(lái)所用的工具是

，用

將淀粉酶基因與載體拼接成新的DNA分子，下一步將該DNA分子

，以完成工程菌的構(gòu)建。（2）若要鑒定淀粉酶基因是否插入釀酒酵母菌，可采用的檢測(cè)方法是

；若要鑒定淀粉酶基因是否翻譯成淀粉酶，可采用

檢測(cè)；將該工程菌第17頁(yè)/共63頁(yè)接種在含淀粉的固體平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一定時(shí)間后，加入碘液，工程菌周圍出現(xiàn)透明圈，該現(xiàn)象發(fā)生的原因是

。（3）如何進(jìn)一步鑒定不同的轉(zhuǎn)基因工程菌菌株利用淀粉能力的大??？

。（4）微生物在基因工程領(lǐng)域中有哪些重要作用？

。解析限制酶可以識(shí)別并切割DNA分子的特定部位；用DNA連接酶來(lái)連接兩段DNA分子；用DNA分子雜交技術(shù)來(lái)檢測(cè)DNA分子或RNA分子；用抗原—抗體雜第18頁(yè)/共63頁(yè)交法來(lái)檢測(cè)特定的蛋白質(zhì)。淀粉酶可以使淀粉水解，所以加入碘液后培養(yǎng)基中淀粉被水解的區(qū)域不會(huì)變藍(lán)。答案（1）限制酶（限制性核酸內(nèi)切酶）DNA連接酶導(dǎo)入受體細(xì)胞（2）DNA分子雜交技術(shù)抗原—抗體雜交或淀粉酶活性該工程菌產(chǎn)生的淀粉酶可分泌至培養(yǎng)基，水解淀粉后的區(qū)域，遇碘不再變藍(lán)色，產(chǎn)生透明圈（3）測(cè)定相同培養(yǎng)條件下不同工程菌菌株的淀粉酶活性或酒精產(chǎn)量（4）①工具酶主要來(lái)自微生物；②最重要的目的基因供體庫(kù)之一；③目的基因的載體之一；④作為受體細(xì)胞；⑤提供用于發(fā)酵的工程菌第19頁(yè)/共63頁(yè)考點(diǎn)二細(xì)胞工程的原理和應(yīng)用1.動(dòng)、植物細(xì)胞工程技術(shù)手段的原理和工具酶比較植物細(xì)胞工程動(dòng)物細(xì)胞工程原理①植物組織培養(yǎng)——細(xì)胞全能性②植物體細(xì)胞雜交——細(xì)胞的全能性、細(xì)胞膜流動(dòng)性①動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)——細(xì)胞增殖②體細(xì)胞核移植——?jiǎng)游锛?xì)胞核的全能性③單克隆抗體的制備——細(xì)胞膜的流動(dòng)性、細(xì)胞增殖④動(dòng)物細(xì)胞融合——細(xì)胞膜流動(dòng)性工具酶纖維素酶、果膠酶胰蛋白酶、膠原蛋白酶第20頁(yè)/共63頁(yè)2.動(dòng)、植物細(xì)胞全能性（1）原因：生物體的每個(gè)細(xì)胞都有發(fā)育成完整個(gè)體所必需的全部基因。（2）全能性表現(xiàn)的大?。菏芫训娜苄宰畲?，其次是生殖細(xì)胞，體細(xì)胞相對(duì)較小。（3）全能性表現(xiàn)與細(xì)胞種類有關(guān)：離體的植物體細(xì)胞的全能性在一定條件下可充分體現(xiàn)。離體的動(dòng)物體細(xì)胞，全能性受到限制，但其細(xì)胞核仍具有全能性，需要借助卵細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)才能體現(xiàn)出來(lái)。未離體細(xì)胞的全能性不能表達(dá)，只能在機(jī)體調(diào)控下定向分化。（4）細(xì)胞的全能性是植物細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ)。第21頁(yè)/共63頁(yè)3.植物體細(xì)胞雜交與動(dòng)物細(xì)胞融合的比較項(xiàng)目植物體細(xì)胞雜交動(dòng)物細(xì)胞融合細(xì)胞融合原理細(xì)胞膜的流動(dòng)性細(xì)胞膜的流動(dòng)性細(xì)胞融合方法用纖維素酶、果膠酶去除細(xì)胞壁后，誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合用胰蛋白酶使細(xì)胞分散后，誘導(dǎo)細(xì)胞融合誘導(dǎo)手段離心、電刺激、振動(dòng)、顯微操作、聚乙二醇等誘導(dǎo)與植物體細(xì)胞雜交相比，還可用滅活的病毒誘導(dǎo)用途克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙，擴(kuò)展雜交親本范圍，培育新品種制備單克隆抗體、病毒疫苗、干擾素等第22頁(yè)/共63頁(yè)4.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)與植物組織培養(yǎng)的比較項(xiàng)目植物組織培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基的物理性質(zhì)固體液體培養(yǎng)基的成分水、礦質(zhì)元素、維生素、蔗糖、氨基酸、激素、瓊脂等葡萄糖、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽、維生素、動(dòng)物血清等結(jié)果新的植株或組織新的細(xì)胞系或細(xì)胞株目的①植株快速繁殖②脫毒植株的培育③人工種子④生產(chǎn)藥物、殺蟲(chóng)劑等⑤轉(zhuǎn)基因植物的培育①蛋白質(zhì)生物制品的生產(chǎn)②皮膚移植材料的培育③檢測(cè)有毒物質(zhì)④生理、病理、藥理學(xué)研究第23頁(yè)/共63頁(yè)取材植物幼嫩的部位或花藥等動(dòng)物胚胎或出生不久的幼齡動(dòng)物的器官或組織其他條件均為無(wú)菌操作，需要適宜的溫度、pH等條件

（09·江蘇卷）動(dòng)物器官的體外培養(yǎng)技術(shù)對(duì)于研究器官的生理、病理過(guò)程及其機(jī)制意義重大。下圖是一個(gè)新生小鼠的肝臟小塊培養(yǎng)裝置示意圖。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：第24頁(yè)/共63頁(yè)（1）肝臟切成小薄片，這有利于肝臟細(xì)胞

。（2）氣室中充入5％CO2：氣體的主要作用是

。（3）培養(yǎng)液中添加抗生素是為了抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，但要注意選擇抗生素的

，以保證抗生素對(duì)肝臟無(wú)害。（4）有機(jī)物X有毒性，可誘發(fā)染色體斷裂。利用上圖所示裝置和提供的下列材料用具，探究肝臟小塊對(duì)有機(jī)物X是否具有解毒作用。材料用具：肝臟小塊，外周血淋巴細(xì)胞，淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液，植物凝集素（刺激淋巴細(xì)胞分裂）；顯微鏡，載玻片，蓋玻片，玻璃皿，滴管；吉姆薩染液（使染色體著色），有機(jī)物X溶液等。第25頁(yè)/共63頁(yè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程：①在淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中加入植物凝集素培養(yǎng)淋巴細(xì)胞，取4等份，備用。②利用甲、乙、丙、丁4組上圖所示裝置，按下表步驟操作（“√”表示已完成的步驟）。甲乙丙丁步驟一：加入肝臟培養(yǎng)液√√√√步驟二：加入有機(jī)物X溶液√√步驟三：放置肝臟小塊√上表中還需進(jìn)行的操作是

。③培養(yǎng)一段時(shí)間后，取4組裝置中的等量培養(yǎng)液，分別添加到4份備用的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。第26頁(yè)/共63頁(yè)④一段時(shí)間后取淋巴細(xì)胞分別染色、制片。在顯微鏡下觀察

，并對(duì)比分析。若丙組淋巴細(xì)胞出現(xiàn)異常，而甲組的淋巴細(xì)胞正常，則說(shuō)明

。解析肝臟是動(dòng)物體內(nèi)最大的消化腺，還有造血和解毒功能。將肝臟切成小薄片，可使肝細(xì)胞直接接觸培養(yǎng)液，有利于肝細(xì)胞吸收氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、排出代謝廢物。向培養(yǎng)液中充入5%CO2，有利于維持培養(yǎng)液的pH。添加抗生素可抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，但不能用錯(cuò)、用多，否則會(huì)傷害甚至殺死肝細(xì)胞。答案（1）吸收氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、排出代謝廢物（2）維持培養(yǎng)液適宜的pH（3）種類和劑量（4）向乙（或?。┙M裝置中放置肝臟小塊染色體形態(tài)和數(shù)量肝臟小塊對(duì)有機(jī)物X具有解毒作用第27頁(yè)/共63頁(yè)

（09·威海二模）日本研究人員依靠體細(xì)胞克隆技術(shù)進(jìn)行反復(fù)“拷貝”，成功培育出第四代克隆豬。這個(gè)研究小組培育的第一代克隆豬于2004年4月誕生，此后，他們又從長(zhǎng)大的克隆豬唾液腺中提取細(xì)胞，將細(xì)胞核植入未受精的卵子中，依次培育出第二代和第三代克隆豬。研究人員發(fā)現(xiàn)，豬與人類身體構(gòu)造相似，克隆豬可作為研究人類疾病的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。根據(jù)材料回答下列問(wèn)題：（1）第四代克隆豬利用了動(dòng)物細(xì)胞核的

性。（2）在細(xì)胞核植入受體卵母細(xì)胞之前，要用顯微針去除卵母細(xì)胞的

，再將唾液腺細(xì)胞核注入。獲得的重組胚胎需要體外培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)不僅要有無(wú)機(jī)鹽第28頁(yè)/共63頁(yè)類和有機(jī)鹽類，而且還要有

等營(yíng)養(yǎng)成分及

等物質(zhì)。當(dāng)發(fā)育到囊胚期時(shí)，將其移植到受體雌動(dòng)物體內(nèi)。（3）研究顯示，利用克隆技術(shù)根本無(wú)法培育出完全相同的個(gè)體，究其原因，除了發(fā)育過(guò)程中的環(huán)境因素的影響外，還可能有

等原因。（4）如果希望克隆豬都能生產(chǎn)人體胰島素，那么需要利用

技術(shù)，把

拼接到豬的核基因中。轉(zhuǎn)基因是否成功都可以用

檢測(cè)。第29頁(yè)/共63頁(yè)解析體細(xì)胞核移植技術(shù)利用了動(dòng)物細(xì)胞核的全能性；在供體細(xì)胞的細(xì)胞核移入受體細(xì)胞之前，必須將受體細(xì)胞的遺傳物質(zhì)去掉或?qū)⑵淦茐?。哺乳?dòng)物胚胎的培養(yǎng)液成分一般都比較復(fù)雜，除一些無(wú)機(jī)鹽類外，還需添加維生素、激素、氨基酸、核苷酸等營(yíng)養(yǎng)成分以及血清等物質(zhì)?？寺〖夹g(shù)根本無(wú)法培育出完全相同的個(gè)體，原因可能是在細(xì)胞分裂中發(fā)生基因突變或個(gè)體發(fā)育中受細(xì)胞質(zhì)基因及環(huán)境的影響?；蛱结樇夹g(shù)的原理是DNA分子雜交，可用于疾病診斷、生物檢測(cè)等。第30頁(yè)/共63頁(yè)（3）細(xì)胞分裂中可能發(fā)生基因突變或卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)也有遺傳物質(zhì)DNA，也控制后代的性狀表達(dá)（4）基因工程人的胰島素基因基因探針答案（1）全能（2）細(xì)胞核維生素、激素、氨基酸、核苷酸動(dòng)物血清第31頁(yè)/共63頁(yè)例1英國(guó)科學(xué)家維爾莫特首次用羊的體細(xì)胞（乳腺細(xì)胞）成功地培育出一只小母羊，取名為“多利”，這一方法被稱為“克隆”，以下四項(xiàng)中與此方法在本質(zhì)上最相近的是 （ ）

A.將兔的早期胚胎分割后，分別植入兩只母兔子宮內(nèi)，并最終發(fā)育成兩只一樣的兔

B.將人的抗病毒基因嫁接到煙草的DNA分子上，培育出具有抗病能力的煙草新品種

C.將鼠骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)過(guò)免疫的腺細(xì)胞融合成雜交瘤細(xì)胞第32頁(yè)/共63頁(yè)D.將人的精子與卵細(xì)胞在體外受精，待受精卵在試管內(nèi)發(fā)育到囊胚期時(shí)，再植入女性子宮內(nèi)發(fā)育成“試管嬰兒”解析“克隆”是采用細(xì)胞核移植技術(shù)，屬于無(wú)性生殖。將兔的早期胚胎分割后，分別植入兩只母兔子宮內(nèi)，并最終發(fā)育成兩只一樣的兔屬于胚胎分割移植，屬無(wú)性生殖。將人的抗病毒基因嫁接到煙草的DNA分子上，培育出具有抗病能力的煙草新品種，這屬于基因工程技術(shù)?！霸嚬軏雰骸笔桥咛ヒ浦布夹g(shù)，屬于有性生殖。答案

A方法點(diǎn)撥做好本題的關(guān)鍵是要準(zhǔn)確區(qū)分胚胎移植、胚胎分割移植和細(xì)胞核移植技術(shù)。第33頁(yè)/共63頁(yè)例2如圖為某種質(zhì)粒表達(dá)載體簡(jiǎn)圖，小箭頭所指分別為限制性EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位點(diǎn)，

ampR為青霉素抗性基因，terR為四環(huán)素抗性基因，P為啟動(dòng)子，T為終止子，ori

為復(fù)制原點(diǎn)。已知目的基因的兩端分別有包括EcoRⅠ、BamHⅠ在內(nèi)的多種酶的酶切位點(diǎn)。據(jù)圖回答下列問(wèn)題：（1）將含有目的基因的DNA與質(zhì)粒表達(dá)載體分別用EcoRⅠ酶切，酶切產(chǎn)物用DNA連接酶進(jìn)行連接后，其中由兩個(gè)DNA片段之間連接形成的產(chǎn)物有

、

、

三種。若要從這些連接產(chǎn)物中分離出重組質(zhì)粒，需要對(duì)這些連接產(chǎn)物進(jìn)行

。第34頁(yè)/共63頁(yè)（2）用上述3種連接產(chǎn)物與無(wú)任何抗藥性的原核宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。之后將這些宿主細(xì)胞接種到含四環(huán)素的培養(yǎng)基中，能生長(zhǎng)的原核宿主細(xì)胞所含有的連接物是

；若接種到含青霉素的培養(yǎng)基中，能生長(zhǎng)的原核宿主細(xì)胞所含有的連接產(chǎn)物是

。（3）目的基因表達(dá)時(shí)，RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)是

，其合成的產(chǎn)物是

。（4）在上述實(shí)驗(yàn)中，為了防止目的基因和質(zhì)粒表達(dá)載體在酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意連接，酶切時(shí)應(yīng)選用的酶是

。第35頁(yè)/共63頁(yè)解析（1）用EcoRⅠ酶切出的目的基因和質(zhì)粒具有相同的黏性末端，如果放在一起加入DNA連接酶，則可出現(xiàn)三種連接結(jié)果，即會(huì)出現(xiàn)目的基因自身形成的連接物，載體自身形成的連接物和重組質(zhì)粒，要通過(guò)篩選、純化才能選出符合要求的DNA。（2）載體自身形成的連接物能重新形成完整的tetR基因，具有抗四環(huán)素的特點(diǎn)，其他連接物中tetR基因被限制酶破壞，不再具有抗四環(huán)素的特點(diǎn)；在整個(gè)操作過(guò)程中，ampR基因保持完整，質(zhì)粒自身形成的連接物和重組質(zhì)粒都具有抗青霉素的特性。（3）RNA聚合酶與相關(guān)基因的啟動(dòng)子結(jié)合，完成的是轉(zhuǎn)錄過(guò)程。（4）將含有目的基因的靶DNA片段和載體分別用兩個(gè)不同的第36頁(yè)/共63頁(yè)限制酶切割，使兩種DNA片段自身的5′和3′黏性末端不同，但二者相同末端又互補(bǔ)，這明顯減少靶DNA片段和載體自身環(huán)化與串連，使外源DNA片段能正確插入載體啟動(dòng)子下游。在本題中目的基因兩端有EcoRⅠ酶切點(diǎn)和BamHⅠ酶切點(diǎn)，在質(zhì)粒載體上也有這兩種酶的切點(diǎn)，所以可以用這兩種酶切出非同源性互補(bǔ)末端來(lái)阻止其他連接。答案（1）目的基因—載體連接物載體—載體連接物目的基因—目的基因連接物分離純化（2）載體—載體連接物目的基因—載體連接物、載體—載體連接物（3）啟動(dòng)子mRNA（4）EcoRⅠ和BamHⅠ第37頁(yè)/共63頁(yè)錯(cuò)因分析由于對(duì)基因工程工具酶的應(yīng)用理解不到位，特別是兩種工具酶與獲取目的基因和表達(dá)載體之間的聯(lián)系與拓展掌握不好，造成錯(cuò)誤。第（1）小題中，由于含有目的基因的DNA片段和質(zhì)粒上均含有EcoRⅠ酶的切割位點(diǎn)，所以用此酶切割后產(chǎn)生相同的黏性末端。這樣，具有相同的黏性末端的片段用DNA連接酶均可連接，從而產(chǎn)生3類連接產(chǎn)物，這是教材知識(shí)的一種拓展，也是最易出錯(cuò)的地方。第38頁(yè)/共63頁(yè)1.（09·浙江理綜）下列關(guān)于基因工程的敘述，錯(cuò)誤的是 ( )A.目的基因和受體細(xì)胞均可來(lái)自動(dòng)、植物或微生物

B.限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶是兩類常用的工具酶

C.人胰島素原基因在大腸桿菌中表達(dá)的胰島素原無(wú)生物活性

D.載體上的抗性基因有利于篩選含重組DNA的細(xì)胞和促進(jìn)目的基因的表達(dá)第39頁(yè)/共63頁(yè)解析基因工程中目的基因和受體細(xì)胞均可來(lái)自動(dòng)、植物或微生物；常用的工具酶是限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶；人胰島素原基因在大腸桿菌中表達(dá)的胰島素原無(wú)生物活性，只有經(jīng)過(guò)一定的物質(zhì)激活以后，才有生物活性。載體上的抗性基因主要是有利于篩選含重組DNA的細(xì)胞，不能促進(jìn)目的基因的表達(dá)。所以D錯(cuò)誤。答案

D2.（09·廣東理基）錢(qián)永健先生因在研究綠色熒光蛋白 方面的杰出成就而獲2008年諾貝爾獎(jiǎng)。在某種生物 中檢測(cè)不到綠色熒光，將水母綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn) 入該生物體內(nèi)后，結(jié)果可以檢測(cè)到綠色熒光。由此 可知 （ ）第40頁(yè)/共63頁(yè)A.該生物的基因型是雜合的

B.該生物與水母有很近的親緣關(guān)系

C.綠色熒光蛋白基因在該生物體內(nèi)得到了表達(dá)

D.改變綠色熒光蛋白基因的1個(gè)核苷酸對(duì)，就不能檢測(cè)到綠色熒光

解析某種生物中檢測(cè)不到綠色熒光，將水母綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)入該生物體內(nèi)后，結(jié)果可以檢測(cè)到綠色熒光，說(shuō)明綠色熒光蛋白基因在該生物體內(nèi)得到了表達(dá)。

答案

C第41頁(yè)/共63頁(yè)3.（09·浙江理綜）用動(dòng)、植物成體的體細(xì)胞進(jìn)行離體培養(yǎng)，下列敘述正確的是 ( )

A.都需用CO2培養(yǎng)箱

B.都須用液體培養(yǎng)基

C.都要在無(wú)菌條件下進(jìn)行

D.都可體現(xiàn)細(xì)胞的全能性

解析動(dòng)、植物成體的體細(xì)胞進(jìn)行離體培養(yǎng)都要在無(wú)菌條件下進(jìn)行；動(dòng)物成體的體細(xì)胞離體培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基，不能體現(xiàn)細(xì)胞的全能性；植物成體的體細(xì)胞離體培養(yǎng)不一定用液體培養(yǎng)基，能體現(xiàn)細(xì)胞的全能性。C第42頁(yè)/共63頁(yè)4.（08·寧夏理綜）回答下列有關(guān)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的問(wèn)題：（1）在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長(zhǎng) 到細(xì)胞表面

時(shí)，細(xì)胞會(huì)停止分裂增殖，這種 現(xiàn)象稱為細(xì)胞的

。此時(shí)，瓶壁上形成的細(xì) 胞層數(shù)是

。要使貼壁的細(xì)胞從瓶壁上分離下 來(lái)，需要用酶處理，可用的酶是

。（2）隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增多，絕大部分細(xì)胞分裂 停止，進(jìn)而出現(xiàn)

的現(xiàn)象；但極少數(shù)細(xì)胞可 以連續(xù)增殖，其中有些細(xì)胞會(huì)因遺傳物質(zhì)發(fā)生改變 而變成

細(xì)胞，該種細(xì)胞的黏著性

，細(xì) 胞膜表面蛋白質(zhì)（糖蛋白）的量

。 （3）現(xiàn)用某種大分子染料，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)，觀 察到死細(xì)胞被染色，而活細(xì)胞不染色，原因是

。第43頁(yè)/共63頁(yè)（4）檢查某種毒物是否能改變細(xì)胞染色體的數(shù)目，最好選用細(xì)胞分裂到

期的細(xì)胞用顯微鏡進(jìn)行觀察。（5）在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，通常在

條件下保存細(xì)胞。因?yàn)樵谶@種條件下，細(xì)胞中

的活性降低，細(xì)胞的

速率降低。（6）給患者移植經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)形成的皮膚組織后，發(fā)生了排斥現(xiàn)象，這是因?yàn)闄C(jī)體把移植的皮膚組織當(dāng)作

進(jìn)行攻擊。解析細(xì)胞增殖過(guò)程中存在接觸抑制現(xiàn)象，即正常細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)表現(xiàn)為貼壁生長(zhǎng)和匯合成單層后停止生長(zhǎng)，需用胰蛋白酶處理后再分瓶培養(yǎng)；在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，部分細(xì)胞的遺傳物質(zhì)會(huì)發(fā)生改變，會(huì)增加細(xì)第44頁(yè)/共63頁(yè)胞分裂的次數(shù)；活細(xì)胞的細(xì)胞膜具有選擇透過(guò)性，大分子染料無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，因此不能著色；進(jìn)行器官移植時(shí)，會(huì)發(fā)生免疫排斥，移植的器官會(huì)被機(jī)體當(dāng)作抗原。答案（1）相互接觸接觸抑制單層（或一層）胰蛋白酶（2）衰老甚至死亡不死性降低減少（3）由于活細(xì)胞的膜具有選擇透過(guò)性，大分子染料不能進(jìn)入活細(xì)胞內(nèi)，故活細(xì)胞不能著色（或由于死細(xì)胞的膜喪失了選擇透過(guò)性，大分子染料能夠進(jìn)入死細(xì)胞內(nèi)而著色）（4）中（5）冷凍（或超低溫、液氮）酶新陳代謝（6）抗原第45頁(yè)/共63頁(yè)5.（09·山東理綜）人類在預(yù)防與診療傳染性疾病過(guò)程中，經(jīng)常使用疫苗和抗體。已知某傳染性疾病的病原體為RNA病毒，該病毒表面的A蛋白為主要抗原，其疾苗生產(chǎn)和抗體制備的流程之一如下圖：請(qǐng)回答：第46頁(yè)/共63頁(yè)（1）過(guò)程①代表的是

。（2）過(guò)程②構(gòu)建A基因表達(dá)載體時(shí)，必須使用

和

兩種工具酶。（3）過(guò)程③采用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)是

，獲得的X是

。（4）對(duì)健康人進(jìn)行該傳染病免疫預(yù)防時(shí)，可選用圖中基因工程生產(chǎn)的

所制備的疫苗。對(duì)該傳染病疑似患者確診時(shí)，可從疑似患者體內(nèi)分離病毒，與已知病毒進(jìn)行

比較；或用圖中的

進(jìn)行特異性結(jié)合檢測(cè)。解析（1）中心法則中，對(duì)于少數(shù)的以RNA為遺傳物質(zhì)的病毒，其遺傳信息的傳遞過(guò)程需要補(bǔ)充的過(guò)程有RNA的逆轉(zhuǎn)錄和RNA的復(fù)制過(guò)程，圖中過(guò)程①正代表第47頁(yè)/共63頁(yè)的是逆轉(zhuǎn)錄的過(guò)程。（2）基因工程的步驟是：目的基因的提取構(gòu)建基因表達(dá)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞目的基因的檢測(cè)和表達(dá)，其中構(gòu)建基因表達(dá)載體中需要限制酶來(lái)切割以獲取目的基因，同時(shí)需要相同的限制酶切割載體以獲取與目的基因相同的黏性末端，再通過(guò)DNA連接酶連接目的基因和載體。（3）過(guò)程③是將瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合的過(guò)程，獲得的叫雜交瘤細(xì)胞，其具備了瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖的特性和B淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生抗體的特性，從而制備單克隆抗體。（4）本題考查了免疫預(yù)防的操作過(guò)程，以及欲確診第48頁(yè)/共63頁(yè)疑似患者而采取的方法。本題中提示該RNA病毒表面的A蛋白為主要的抗原，故而可選用通過(guò)基因工程生產(chǎn)的A蛋白制備疫苗；確診時(shí)為判斷該病毒是否為題目中的RNA病毒，可以進(jìn)行核酸序列的比對(duì)，也可以利用單克隆抗體具備的特異性，利用抗A蛋白的特異性單克隆抗體與患者體內(nèi)分離的病毒能否特異性結(jié)合判斷病毒表面是否有A蛋白的存在進(jìn)一步進(jìn)行檢測(cè)是否為目的RNA病毒。答案（1）逆（反）轉(zhuǎn)錄（2）限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）DNA連接酶（兩空可以互換）（3）細(xì)胞融合雜交瘤細(xì)胞（4）A蛋白核酸（基因）序列抗A蛋白的單克隆抗體第49頁(yè)/共63頁(yè)6.（09·廣東生物）（1）飼料加工過(guò)程溫度較高，要求植酸酶具有較好的高溫穩(wěn)定性。利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)對(duì)其進(jìn)行改造時(shí)，首先必須了解植酸酶的

，然后改變植酸酶的

，從而得到新的植酸酶。（2）培育轉(zhuǎn)植酸酶基因的大豆，可提高其作為飼料原料時(shí)磷的利用率。將植酸酶基因?qū)氪蠖辜?xì)胞常用的方法是

。請(qǐng)簡(jiǎn)述獲得轉(zhuǎn)基因植株的完整過(guò)程。

。第50頁(yè)/共63頁(yè)（3）為了提高豬對(duì)飼料中磷的利用率，科學(xué)家將帶有植酸酶基因的重組質(zhì)粒通過(guò)

轉(zhuǎn)入豬的受精卵中。該受精卵培養(yǎng)至一定時(shí)期可通過(guò)

方法，從而一次得到多個(gè)轉(zhuǎn)基因豬個(gè)體。（4）若這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)、植物進(jìn)入生態(tài)環(huán)境中，對(duì)生態(tài)環(huán)境有何影響？

。第51頁(yè)/共63頁(yè)解析（1）蛋白質(zhì)工程首先要根據(jù)已有蛋白質(zhì)，從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)，設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列，找到相應(yīng)的脫氧核苷酸序列，合成目的基因，再通過(guò)基因工程產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物。（2）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法有：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法，其中有80%的轉(zhuǎn)基因植物都是通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法產(chǎn)生的。（3）動(dòng)物細(xì)胞核的全能性受細(xì)胞質(zhì)的抑制，故目的基因需注入到受精卵中，再將注射了目的基因的受精卵移植到雌性動(dòng)物的輸卵管或子宮內(nèi)，使其發(fā)育成具有新性狀的動(dòng)物。（4）轉(zhuǎn)基因生物可造成基因污染等不良影響。第52頁(yè)/共63頁(yè)答案（1）分子結(jié)構(gòu)及預(yù)期功能基因（2）農(nóng)桿菌浸染法首先將目的基因質(zhì)粒組合，構(gòu)建基因表達(dá)載體，將含目的基因的表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞，通過(guò)植物組織培養(yǎng)獲得表現(xiàn)新性狀的植物（3）顯微注射法胚胎分割（4）轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品對(duì)生物多樣性、生態(tài)環(huán)境可能產(chǎn)生的影響主要表現(xiàn)在以下幾方面：①轉(zhuǎn)基因生物打破了物種的原有界限，改變了物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性造成破壞；②重組DNA與微生物雜交，可能出現(xiàn)對(duì)動(dòng)、植物和人類有害的病原微生物；③增加目標(biāo)害蟲(chóng)的抗性和進(jìn)化速度；④轉(zhuǎn)基因植物通過(guò)傳粉進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致超級(jí)雜草出現(xiàn)；⑤轉(zhuǎn)基因植物的花粉如含有有毒蛋白或過(guò)敏蛋白，通過(guò)蜜蜂的采集，很可能進(jìn)入蜜蜂中，再經(jīng)過(guò)食物鏈的傳遞，最后有可能進(jìn)入其他動(dòng)物和人體內(nèi)第53頁(yè)/共63頁(yè)7.（09·南通、揚(yáng)州、泰州3月聯(lián)考）降鈣素是一種多肽類激素，臨床上用于治療骨質(zhì)疏松癥等。人的降鈣素活性很低，半衰期較短。某科學(xué)機(jī)構(gòu)為了研發(fā)一種活性高、半衰期長(zhǎng)的新型降鈣素，從預(yù)期新型降鈣素的功能出發(fā)，推測(cè)相應(yīng)的脫氧核苷酸序列，并人工合成了兩條72個(gè)堿基的DNA單鏈，兩條鏈通過(guò)18個(gè)堿基對(duì)形成部分雙鏈DNA片段，再利用Klenow酶補(bǔ)平，獲得雙鏈DNA，過(guò)程如圖。第54頁(yè)/共63頁(yè)在此過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，合成較長(zhǎng)的核苷酸單鏈易產(chǎn)生缺失堿基的現(xiàn)象。分析回答下列問(wèn)題：（1）Klenow酶是一種

酶，合成的雙鏈DNA有個(gè)

堿基對(duì)。（2）獲得的雙鏈DNA經(jīng)EcoRⅠ（識(shí)別序列和切割位點(diǎn)—G↓AATTC—）BamHⅠ（識(shí)別序列和切割位點(diǎn)—G↓GATCC—）雙酶切后插入到大腸桿菌質(zhì)粒中，篩選含重組質(zhì)粒的大腸桿菌并進(jìn)行DNA測(cè)序驗(yàn)證。①大腸桿菌是理想的受體細(xì)胞，這是因?yàn)樗?/p>

。第55頁(yè)/共6