第四章工業(yè)發(fā)酵滅菌第一節(jié)、滅菌的方法消毒：指用物理和化學方法殺死物料、容器、器具內(nèi)外的病源微生物。一般只能殺死營養(yǎng)細胞而不能殺死細菌芽孢。滅菌：用物理或化學方法殺死或除去環(huán)境中所有微生物，包括營養(yǎng)細胞、細菌芽孢和孢子。作用：消滅雜菌和防止雜菌污染.消毒不一定能達到滅菌要求，而滅菌則可達到消毒的目的。

1、在發(fā)酵生產(chǎn)中，為什么要進行滅菌操作？2、為防止雜菌的污染，哪些物品需要滅菌？培養(yǎng)基、發(fā)酵設(shè)備、空氣、管道、流加料等3、什么時候進行滅菌？生產(chǎn)菌接種前常用滅菌方法：干熱滅菌、濕熱滅菌、射線滅菌（射線、微波等）、化學滅菌（各種化學藥品）、過濾除菌；1、干熱滅菌法灼燒滅菌、在電熱或紅外線在設(shè)備內(nèi)加熱主要用于保持干燥的物料、器具等.常用烘箱，滅菌條件為在160℃下保溫1h原理：根據(jù)氧化作用導致微生物死亡。濕熱滅菌的原理濕熱滅菌的優(yōu)點：1）蒸汽來源容易，操作費用低廉，本身無毒2)蒸汽具有很強的穿透力，滅菌易于徹底3）蒸汽均有很大的潛熱，冷凝后的水分有利于濕熱滅菌4）蒸汽輸送可借助本身的壓強，調(diào)節(jié)方便，技術(shù)管理容易缺點：1)設(shè)備費用高2）不能用于怕受潮的物料滅菌3、射線滅菌紫外線、高速電子流的陰極射線、X射線和Y射線適用范圍：無菌室、培養(yǎng)間問題：是否適于固體、液體物料滅菌？波長范圍？4、化學藥品滅菌法（1）第一大類：表面消毒劑高錳酸鉀溶液：0.1～0.25%、漂白粉、75％的酒精、新潔爾滅和杜滅芬、甲醛37％、戊二醛、過氧乙酸、焦碳酸二乙酯、酚類。（作用原理？適用范圍？）（2）第二大類：抗代謝藥物化學結(jié)構(gòu)與微生物必須的代謝物類似物例如：磺胺類化合物取代氨基苯甲酸（3）第三大類：抗生素不同種類其作用不同，要有針對性選擇。適用范圍：環(huán)境空氣、皮膚及器械的表面消毒問題說說芽孢或孢子的熱阻要比營養(yǎng)細胞的熱阻大的原因？芽孢或孢子的熱阻要比生長期營養(yǎng)細胞的熱阻大得多，這是由于芽孢或孢子內(nèi)吡啶二羧酸含量對熱阻的增加有關(guān)。另外，芽孢子中蛋白質(zhì)含水量較營養(yǎng)細胞低（特別是游離水分少），也是芽孢耐熱強的一個原因。

芽孢與營養(yǎng)細胞的耐受力，哪個強？一級反應(yīng)：用N表示殘留活菌個數(shù)，則活菌的減少率（死亡率），與N呈線性關(guān)系，即：式中，K是反應(yīng)速度常數(shù)，對滅菌來講，是活菌的比熱致死速率常數(shù)，單位是min-1，其值與菌的種類和加熱溫度有關(guān)，需通過實驗才能測定。2、微生物的熱致死動力學：對數(shù)殘留定律051025121116110108從上述的微生物對數(shù)死亡規(guī)律可知，如果要達到徹底滅菌，即滅菌結(jié)束時殘留的活微生物數(shù)等于0，則滅菌所需的時間應(yīng)為無限長，這在實際中是不可能的。工程上，在進行滅菌的設(shè)計時，常認為

Nθ

=0.001，即在1000次滅菌中，允許有一次失敗。3、熱致死反應(yīng)的速度常數(shù)K

K是表達微生物耐熱性的特征常數(shù)，與微生物的種類和滅菌溫度有關(guān)。K越小，微生物越耐熱。溫度越低，K值越小。

例：

在121度，枯草桿菌FS5230的K為0.047s-1，梭狀芽孢桿菌PA3679的K值為0.03s-1，請問哪一種微生物更耐熱？培養(yǎng)基滅菌的要求：達到要求的無菌程度（10-3）盡量減少營養(yǎng)成分的破壞，在滅菌過程中，培養(yǎng)基組分的破壞，是由兩個基本類型的反應(yīng)引起的：培養(yǎng)基中不同營養(yǎng)成分間的相互作用；對熱不穩(wěn)定的組分如氨基酸和維生素等的分解。4、滅菌的溫度和時間培養(yǎng)基濕熱滅菌需解決的工程問題將培養(yǎng)基中的雜菌總數(shù)N0殺滅到可以接受的總數(shù)N（10-3），需要多高的溫度、多長的時間為合理。滅菌溫度和時間的確定取決于：雜菌孢子的熱滅死動力學反應(yīng)器的形式和操作方式培養(yǎng)基中有效成分受熱破壞的可接受范圍A---比例常數(shù)，也稱阿累尼烏斯常數(shù)，s-1；R---氣體常數(shù)，8.314J/mol·K；T---絕對溫度，K；ΔE---微生物死亡活化能，J/mol。如何選擇一個既能滿足滅菌需要，又可使培養(yǎng)基的破壞盡可能減小的滅菌工藝條件？微生物的受熱死亡屬于單分子反應(yīng)，其滅菌速率常數(shù)K與溫度之間的關(guān)系可用阿累尼烏斯公式表示：K`---培養(yǎng)基內(nèi)易被破壞成分的分解速率常數(shù)；A`---頻率常數(shù)，也稱阿累尼烏斯常數(shù)，s-1；R---氣體常數(shù)，8.314J/mol·K；T---絕對溫度，K；ΔE`---培養(yǎng)基成分分解所需活化能，J/mol。

滅菌時，培養(yǎng)基成分分解速率常數(shù)K`與溫度之間的關(guān)系也可用阿累尼烏斯公式表示：當培養(yǎng)基成分從T1上升到T2時，微生物的死亡速率與培養(yǎng)基的分解有如下關(guān)系：

即隨著溫度的上升，微生物的死亡速率常數(shù)增加倍數(shù)要大于培養(yǎng)基成分的破壞速率的增加倍數(shù)。結(jié)論1：當滅菌溫度上升時，微生物殺死速率的提高要超過培養(yǎng)基成分的破壞速率的增加。滅菌時殺死微生物的活化能大于培養(yǎng)基成分的破壞活化能值，因此：

由此可見，若要減少營養(yǎng)成分的破壞，可升高溫度滅菌。結(jié)論2：在滅菌時選擇較高的溫度、較短的時間，這樣便既可達到需要的滅菌程度，同時又可減少營養(yǎng)物質(zhì)的損失。

四、影響培養(yǎng)基滅菌的其他因素培養(yǎng)基成分、pH值、培養(yǎng)基中的顆粒、泡沫五、分批滅菌和連續(xù)滅菌（一）、分批滅菌

24016012080時間（min)050100150溫度升溫冷卻保溫發(fā)酵罐過程包括：升溫（后期滅菌）、保溫和冷卻（初期滅菌）等三個階段。

各階段對滅菌的貢獻：20%、75%、5%右圖為培養(yǎng)基間歇滅菌過程中溫度變化情況。1、定義：將配制好的培養(yǎng)基同時放在發(fā)酵罐或其他裝置中，通入蒸汽將培養(yǎng)基和所用設(shè)備一起進行加熱滅菌的過程，通常也稱為實罐滅菌。（常用）3、分批滅菌的操作

分批滅菌是在所用的發(fā)酵罐或其他培養(yǎng)裝置中進行的，它是在配制罐中配好培養(yǎng)基后，通過專用管道輸入發(fā)酵罐等培養(yǎng)設(shè)備中，然后開始滅菌。在進行培養(yǎng)基的間歇滅菌之前，通常先將發(fā)酵罐等培養(yǎng)裝置的分空氣過濾器進行滅菌，并且用空氣將分過濾器吹干。開始滅菌時，應(yīng)先放去夾套或蛇管中的冷水，開啟排氣管閥，通過空氣管向發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)基通入蒸汽進行加熱，同時，也可在夾套內(nèi)通蒸汽進行間接加熱。當培養(yǎng)基溫度升到70℃左右時，從取樣管和放料管向罐內(nèi)通入蒸汽進一步加熱，當溫度升至120℃

，罐壓為1*105Pa（表壓）時，打開接種、補料、消泡劑、酸、堿等管道閥門進行排氣，當然在保溫過程中，應(yīng)注意凡在培養(yǎng)基液面下的各種進口管道都應(yīng)通入蒸汽，而在液面以上的其余各管道則應(yīng)排放蒸汽，這樣才能不留死角，從而保證滅菌徹底。3、分批滅菌的操作保溫結(jié)束后，依次關(guān)閉各排汽、進汽閥門，待罐內(nèi)壓力低于空氣壓力后，向罐內(nèi)通入無菌空氣，在夾套或蛇管中通冷水降溫，使培養(yǎng)基的溫度降到所需的溫度，進行下一步的發(fā)酵和培養(yǎng)。間歇培養(yǎng)特點：由于培養(yǎng)基的間歇滅菌不需要專門的滅菌設(shè)備，投資少，對設(shè)備要求簡單，對蒸汽的要求也比較低，且滅菌效果可靠，因此，間歇滅菌是中小型生產(chǎn)工廠經(jīng)常采用的一種培養(yǎng)基滅菌方法。4保證間歇滅菌成功的要素內(nèi)部結(jié)構(gòu)合理(主要是無死角)，焊縫及軸封裝置可靠，蛇管無穿孔現(xiàn)象壓力穩(wěn)定的蒸汽合理的操作方法。發(fā)酵罐的接管圖4、分批滅菌的注意事項1）各路蒸汽進口要暢通，防止短路逆流；罐內(nèi)液體翻動要劇烈，以使罐內(nèi)物料達到均一的滅菌溫度。2）排氣量不宜過大，以節(jié)約蒸汽3）滅菌將要結(jié)束時，應(yīng)立即引入無菌空氣以保持罐壓，然后開夾套或蛇管冷卻，以避免罐壓迅速下降產(chǎn)生負壓而吸入外界空氣，或引起發(fā)酵罐破壞。4）在引入無菌空氣前，罐內(nèi)壓力必須低于過濾器壓力，否則培養(yǎng)基將倒流入過濾器。（二）、連續(xù)滅菌

1、定義：

將配制好的培養(yǎng)基在向發(fā)酵罐等培養(yǎng)裝置輸送的同時進行加熱、保溫和冷卻而進行滅菌。連續(xù)滅菌的基本設(shè)備一般包括（1）配料預熱罐，將配制好的料液預熱到60-70℃

，以避免連續(xù)滅菌時由于料液與蒸汽溫度相差過大而產(chǎn)生水汽撞擊聲；（2）連消塔，連消塔的作用主要是使高溫蒸汽與料液迅速接觸混和，并使料液的溫度很快升高到滅菌溫度（126-132℃

）；（3）維持罐，連消塔加熱的時間很短，光靠這段時間的滅菌是不夠的，維持罐的作用是使料液在滅菌溫度下保持5-7min，以達到滅菌的目的；（4）冷卻管，從維持罐出來的料液要經(jīng)過冷卻排管進行冷卻，生產(chǎn)上一般采用冷水噴淋冷卻，冷卻到40-50℃后，輸送到預先已經(jīng)滅菌過的罐內(nèi)。發(fā)酵罐蒸汽蒸汽冷卻水無菌培養(yǎng)基配料罐泵加熱塔維持罐冷卻管

連續(xù)滅菌的基本設(shè)備有哪些？問題2、連續(xù)滅菌的優(yōu)點：1）可以采用高溫短時滅菌；2）發(fā)酵罐利用率高；3）蒸汽負荷均衡；4）熱效率高；5）可采用自動控制，降低勞動強度；3、連續(xù)滅菌時間的計算

如果不計升溫階段所殺滅的菌數(shù)，把培養(yǎng)基中所有的菌均看作是在保溫階段（滅菌溫度）被殺滅，這樣可以簡單地利用右式，粗略地求得滅菌所需的時間：4、連續(xù)滅菌流程

六、間歇滅菌與連續(xù)滅菌的比較

滅菌方式優(yōu)點缺點連續(xù)滅菌1.

滅菌溫度高，可減少培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的損失2.

操作條件恒定，滅菌質(zhì)量穩(wěn)定3.

易于實現(xiàn)管道化和自控操作4.

避免了反復的加熱和冷卻，提高了熱的利用率5.

發(fā)酵設(shè)備利用率高1.

對設(shè)備的要求高，需另外設(shè)置加熱、冷卻裝置2.

操作較麻煩3.

染菌的機會較多4.

不適合于含大量固體物料的滅菌5.

對蒸汽的要求高間歇滅菌1.

設(shè)備要求低，不需另外設(shè)置加熱、冷卻裝置2.

操作要求低，適于手動操作3.

適合于小批量生產(chǎn)規(guī)模4.

適合于含有大量固體物質(zhì)的培養(yǎng)基的滅菌1.

培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)損失較多，滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量下降2.

需進行反復的加熱和冷卻，能耗較高3.

不適合于大規(guī)模生產(chǎn)過程的滅菌4.

發(fā)酵罐的利用率較低加熱器、維持罐（管）和冷卻器以及發(fā)酵罐等都應(yīng)先進滅菌

由表可見，無論在理論上或者在實踐上，與間歇滅菌過程相比，連續(xù)滅菌的優(yōu)點十分明顯。因此，連續(xù)滅菌越來越多地被用培養(yǎng)基的滅菌。七、培養(yǎng)基與設(shè)備、管道滅菌條件1、滅菌鍋內(nèi)滅菌2、種子培養(yǎng)基實罐滅菌3、發(fā)酵培養(yǎng)基實罐滅菌4、發(fā)酵培養(yǎng)基連續(xù)滅菌5、消泡劑滅菌6、補料實罐滅菌7、尿素溶液滅菌謝謝?。劾?-1］［例3-1］有發(fā)酵培養(yǎng)基40m3

，原始污染程度為105個菌/mL，要求無菌程度Ns為10-3個菌/批，若滅菌溫度125℃時滅菌速度常數(shù)為1min-1，求所需要滅菌時間。解：已知N0=40×106×105=4×1012個菌/批

Ns=10-3個菌/批

K=1min-1

將上述數(shù)據(jù)代入

=15×2.303×0.602=20.8(min)［例3-2］［例3-2］假定滅菌溫度為120℃，試比較嗜熱脂肪芽孢桿菌死亡速率常數(shù)ks和維生素B1的分解速率常數(shù)kB。解：已知，嗜熱脂肪芽孢桿菌的活化能E3=283460(J/mol)阿累尼烏斯常數(shù)As=1.06×1036(min-1)氣體常數(shù)R=8.314[J/(mol?K)]熱力學溫度T=120+273=393℃代入式(3-4)中：Ks=1.06×1036×=0.024(min-1)已知維生素B1的活化能EB=92114(J/mol)阿累尼烏斯常數(shù)AB=9.30×1010(min-1)氣體常數(shù)R=8.314[J/(mol?K)]熱力學溫度T=120+273=3