第九章聚合酶鏈反應及相關技術(shù)聚合酶鏈反應于二十世紀80年代由K.Mullis建立，并和定點突變的發(fā)明者M.Smith一起榮獲1993年度

諾貝爾化學獎，為生命科學領域的研究開創(chuàng)了嶄新時代。第一節(jié)聚合酶鏈反應第二節(jié)以PCR為基礎的相關技術(shù)第三節(jié)PCR產(chǎn)物的檢測聚合酶鏈反應（polymerasechainreaction,PCR）是DNA體外復制反應，基本原理與細胞內(nèi)DNA的復制相似第一節(jié)聚合酶鏈反應第一節(jié)聚合酶鏈反應一、PCR反應原理、反應過程和特點二、PCR的反應體系三、PCR的反應條件四、PCR技術(shù)的質(zhì)量控制一、PCR反應原理和反應過程1.原理DNA的體外復制包括3個步驟：變性（denaturation）:94C～95C退火（annealing）:40C～70C

延伸（extension）:72C

變性:DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈分子作為反應的模板退火:引物與模板互補結(jié)合，形成雜交鏈延伸:按照模板鏈的序列以互補的方式依次把dNTP加至引物的3′端，TaqDNA聚合酶使雜交雙鏈不斷延伸，直至形成新的DNA雙鏈一、PCR反應原理和反應過程5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’TaqTaq3’5’3’TaqTaq5’5’循環(huán)延伸繼續(xù)延伸一、PCR反應原理和反應過程5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’3’第二個循環(huán)4個拷貝第三個循環(huán)8個拷貝5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’第n個循環(huán)2n個拷貝一、PCR反應原理和反應過程二、PCR的反應體系參與PCR反應的主要成份:1.模板2.引物3.脫氧核苷三磷酸4.TaqDNA聚合酶5.鎂離子濃度6.其它反應因素1.模板（template）基因組DNA、RNA、質(zhì)粒DNA、線粒體DNA等RNA作為模板時，須先將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA

模板量：1000ng、500ng、100ng、50ng反應體系中較低量的模板有利于提高擴增產(chǎn)量和減少非特異性擴增二、PCR的反應體系2.引物(primer)化學合成的寡核苷酸與模板特異地結(jié)合決定產(chǎn)物的特異性和長度二、PCR的反應體系設計引物的原則(二)引物的堿基組成應平衡，C+G堿基含量在引物中的比例一般以45%～55%為宜引物退火溫度計算：Tm=2（A+T）+4（C+G）引物的5′端可被修飾（引入酶切位點、引入突變位點、生物素等標記）二、PCR的反應體系3.脫氧核苷三磷酸（dNTP）

dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物反應體系中各種核苷酸的濃度必須一致濃度過高雖能加快反應速度，但非特異性擴增也隨之增加最適濃度：20～200μmol/L二、PCR的反應體系4.TaqDNA聚合酶

從一種生活在熱泉（80℃～90℃）中的水棲噬熱菌（Thermusaquaticus,Taq）中提取，有很高的耐熱穩(wěn)定性二、PCR的反應體系TaqDNA聚合酶無3′→5′外切酶活性，因而無校正功能，在復制新鏈的過程中會發(fā)生堿基錯配TaqDNA聚合酶在每次循環(huán)中產(chǎn)生的移碼突變率為1/30000，堿基替換率為1/8000，因此擴增的片段越長，錯配的機率越高二、PCR的反應體系耐熱的高保真

DNA多聚合酶：PwoDNApolymeraseTthDNApolymerasePfuDNApolymerase高熱穩(wěn)定性，高保真性，能降低堿基錯配率二、PCR的反應體系5.鎂離子濃度對反應系統(tǒng)本身、穩(wěn)定核苷酸和提高Taq酶的活性有直接影響PCR反應體系中dNTP、引物、模板DNA及鰲合劑均可與Mg2+結(jié)合，降低游離Mg2+的濃度，影響酶的活性dNTP濃度為200μmol/L時，MgCl2濃度為1.5mmol/L較宜二、PCR的反應體系三、PCR的反應條件

反應溫度（變性、退火、延伸）2.反應時間（變性、退火、延伸）3.循環(huán)次數(shù)（PCR效率及產(chǎn)物量）4.PCR過程的實時監(jiān)測1.反應溫度

變性溫度：94℃～97℃退火溫度：低于引物Tm5℃左右溫度過高：降低擴增效率溫度過低：增加非特異性擴增延伸溫度：72℃三、PCR的反應條件

一個分子的模板經(jīng)過30個循環(huán)，理論上即可得230(約109)個拷貝產(chǎn)物實際反應中，每個循環(huán)的擴增效率大多約為85%左右三、PCR的反應條件

擴增反應的平臺效應：PCR反應產(chǎn)物呈指數(shù)性增長，但這種增長形式在擴增25～35個循環(huán)以后便放慢直至停止，達到反應平臺，此時擴增產(chǎn)物量不再隨循環(huán)次數(shù)的增加而呈指數(shù)增長。三、PCR的反應條件

指數(shù)增長期線形增長期平臺期循環(huán)數(shù)

理論值

實際值Log產(chǎn)物DNA4.PCR實時監(jiān)測三、PCR的反應條件

平臺出現(xiàn)得遲早與模板的初始量有關，模板初始量越多，平臺出現(xiàn)得越早平臺效應產(chǎn)生的因素：引物二聚體的產(chǎn)生反應體系各組分的消耗引物和已擴增的DNA片段間的競爭等三、PCR的反應條件

四、PCR技術(shù)的質(zhì)量控制1.實驗室的規(guī)范化設置試劑貯存和準備區(qū)標本制備區(qū)擴增反應區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)2.防污染體系：正確設置實驗室、嚴格規(guī)范實驗操作、完整有效的去污染措施反應體系中以dUTP取代dTTP，加入尿嘧啶糖苷酶（UNG），破壞以往的擴增產(chǎn)物每次實驗完畢后須用1g/L次氯酸鈉清潔實驗臺面，或用254nm波長的紫外光近距離充分照射四、PCR技術(shù)的質(zhì)量控制3.PCR技術(shù)的質(zhì)量保證基因擴增檢驗的全過程的質(zhì)量保證分析前分析中分析后室內(nèi)質(zhì)量控制和室間質(zhì)量評價四、PCR技術(shù)的質(zhì)量控制第二節(jié)以PCR為基礎的相關技術(shù)第二節(jié)以PCR為基礎的相關技術(shù)一、逆轉(zhuǎn)錄PCR二、定量PCR三、多重PCR四、PCR誘導定點突變五、連接酶鏈式反應六、隨機擴增多態(tài)性DNA一、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）以細胞內(nèi)總RNA或mRNA為材料進行體外擴增的技術(shù)主要用于克隆cDNA、合成cDNA探針，檢測RNA病毒、分析基因表達等逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA所用的引物：以PCR擴增所需的下游引物作為逆轉(zhuǎn)錄反應的引物以oligo(dT)作為引物以人工合成的隨機序列（六核苷酸混合物）作為引物一、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）一、逆轉(zhuǎn)錄PCR二、定量PCR(quantitativePCR)對DNA或RNA樣本的靶序列進行定量分析主要用于基因表達的分析、病原體核酸的檢測等熒光定量PCR（fluorescencequantitativePCR,FQ-PCR），又稱實時PCR(real-timePCR)FQ-PCR通過熒光信號對PCR過程中的產(chǎn)物量進行實時監(jiān)測，精確計算出PCR的初始模板量二、定量PCR熒光信號的檢測方法二、定量PCR1.DNA結(jié)合染料技術(shù)2.水解探針技術(shù)3.雜交探針技術(shù)4.分子信標技術(shù)1.DNA結(jié)合染料技術(shù)PCR反應體系中加入SYBRGreenI染料，能選擇性地摻入至雙鏈DNA分子中，并且產(chǎn)生強烈熒光PCR過程中，SYBRGreenI染料結(jié)合到新合成的雙鏈DNA分子中，結(jié)合的熒光信號和DNA含量成正比二、定量PCR

二、定量PCR優(yōu)點：成本較低，無須對引物或探針進行特殊的熒光標記，操作亦比較簡單缺點：特異性不夠，染料分子會結(jié)合到非特異性擴增產(chǎn)生的雙鏈分子和引物二聚體中，使反應體系中的熒光本底較高二、定量PCR2.水解探針技術(shù)技術(shù)熒光素標記探針探針的5′端和3′端分別標記熒光報告基團R和熒光淬滅基團Q

探針完整時R基團與Q基團分別位于探針的二端，Q基團抑制R基團使其不能發(fā)射熒光二、定量PCR熒光信號檢測PCR過程中，TaqDNA聚合酶沿模板移動，其5′→3′外切核酸酶活性，可逐個水解脫氧核苷三磷酸，R基團與Q基團隨之分離R基團不再受Q基團的抑制便發(fā)射熒光，R基團信號強弱的程度與PCR反應產(chǎn)物的拷貝數(shù)成正比二、定量PCR水解探針技術(shù)二、定量PCR二、定量PCR3.雜交探針技術(shù)（hybridizationprobe）反應體系需要2條探針探針A的3′端標以熒光素作為熒光染料供體；探針B的5′端標以另一種染料，作為熒光染料受體。2個探針的序列頭尾排列，并且相距僅間隔1個堿基，從而能夠進行熒光共振能量的轉(zhuǎn)移二、定量PCR外來光源首先刺激供體熒光染料，供體便發(fā)光刺激附近的受體熒光染料，使后者再發(fā)射出具另一種波長的信號而被檢測系統(tǒng)接收受體熒光染料在2個探針都與模板雜交時才會被激發(fā)而發(fā)射熒光信號二、定量PCR分子信標是一段熒光素標記的寡核苷酸環(huán)狀區(qū)(15～30個核苷酸)柄區(qū)(5～8個堿基對)組成5′末端標記熒光基團3′末端標記淬滅基團4.分子信標技術(shù)（molecularbeacon）二、定量PCR在自由狀態(tài)下，分子信標的結(jié)構(gòu)呈發(fā)夾狀，兩端的基團相距較近，熒光基團將能量轉(zhuǎn)移給淬滅基團而使熒光淬滅，熒光本底極低當分子信標與序列互補的靶分子結(jié)合時，分子信標的構(gòu)型發(fā)生變化，柄部被打開，從而使熒光基團遠離淬滅基團而發(fā)射熒光二、定量PCR分子信標技術(shù)原理R二、定量PCR定量PCR參照系統(tǒng)二、定量PCR1.外參照系統(tǒng)的設置2.內(nèi)參照系統(tǒng)的設置1.外參照系統(tǒng)Ct值(cyclethreshold)擴增曲線與熒光本底基線的交叉點處相應的反應循環(huán)數(shù),即每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)Ct值與模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性反比關系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小二、定量PCR相同模板進行96次擴增的擴增曲線圖二、定量PCR利用已知起始拷貝數(shù)的標準品作出標準曲線，橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代Ct值獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)二、定量PCR2.內(nèi)參照系統(tǒng)內(nèi)標準品:一段人為地引入了突變序列的靶基因片段內(nèi)標準品加入被檢樣品中一起抽提、擴增內(nèi)標準品和靶基因的探針分別用2種不同的熒光染料標記，二者探針雜交的序列不同二、定量PCR同一對引物同時擴增靶基因和內(nèi)標準品，雙通道熒光檢測系統(tǒng)可以特異地同時檢測出內(nèi)標準品和靶基因的擴增產(chǎn)物，計算出靶基因起始拷貝數(shù)內(nèi)參照系統(tǒng)避免了由于不同抽提效率導致的樣本間的差異，使結(jié)果的重復性更好，定量更為準確,但仍不能監(jiān)控內(nèi)標準品和靶基因是否有一致的擴增效率二、定量PCR三、多重PCR(multiplexPCR)

在同一反應體系中加入多對引物，同時擴增一份DNA樣本中多個靶片段四、PCR誘導定點突變1.引入點突變ABABP2P1PCR用酶A和B消化，將突變位點引入PCR產(chǎn)物2.引入大片段缺失四、PCR誘導定點突變五、連接酶鏈反應(LCR）

空隙LCR引物與模板特異性互補引物A和B之間、a和b之間有一段空隙空隙在DNA聚合酶的作用下特異性延伸連接酶連接缺口六、隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)RAPD是一種在整個基因組DNA內(nèi)進行隨機擴增而獲得多態(tài)性長度DNA片段的技術(shù)用一條隨機序列的引物與模板DNA序列作隨機配對，反應過程中隨機引物只有在與模板DNA互補后，在足夠近的間距(200～2000bp)內(nèi)、方向相對的兩個引物片段之間的模板DNA序列才能被擴增六、隨機擴增多態(tài)性DNA不同個體DNA序列之間存在差異或發(fā)生突變，經(jīng)擴增所得到的產(chǎn)物片段長度會有所不同，經(jīng)過電泳分離便可以發(fā)現(xiàn)這種差異，從而可了解和比較兩個生物體之間基因組DNA的結(jié)構(gòu)等信息

隨機擴增多態(tài)性DNA六、隨機擴增多態(tài)性DNARAPD的應用種群生物學研究基因組DNA圖譜構(gòu)建遺傳鑒定臨床致病菌的流行病學檢測和分型DNA指紋鑒定六、隨機擴增多態(tài)性DNA第三節(jié)PCR產(chǎn)物的檢測第三節(jié)PCR產(chǎn)物的檢測一、PCR-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）二、等位基因特異性寡核苷酸（ASO）三、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）四、變性梯度凝膠電泳（DGGE）五、融點曲線分析(meltingcurveanalysis)六、PCR產(chǎn)物的序列分析（sequencing）一、PCR-限制性片段長度多態(tài)性PCR-RFLP是對PCR產(chǎn)物作限制性片段長度多態(tài)性分析根據(jù)PCR產(chǎn)物的突變序列是否位于限制性內(nèi)切酶的酶切位點內(nèi)而設計突變點在某一限制性內(nèi)切酶的酶切位點序列時，可在突變點的二側(cè)設計引物，或通過改變引物序列使擴增產(chǎn)物產(chǎn)生（或消失）酶切位點用相應的內(nèi)切酶對擴增產(chǎn)物進行水解并作電泳分離，PCR產(chǎn)物能（或不能）被酶水解而產(chǎn)生不同長度的片段根據(jù)水解片段的大小和相應電泳位置可區(qū)分野生型和突變型靶基因片段一、PCR-限制性片段長度多態(tài)性EcoRI水解

ABCABC一、PCR-限制性片段長度多態(tài)性二、等位基因特異性寡核苷酸用寡核苷酸探針和PCR產(chǎn)物進行雜交檢測點突變的技術(shù)被檢靶片段經(jīng)PCR擴增并經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移到膜上，分別與經(jīng)標記的野生型和突變型靶基因序列的寡核苷酸探針雜交PCR產(chǎn)物僅與完全互補的探針進行雜交含突變序列的產(chǎn)物僅與突變探針雜交根據(jù)有無雜交信號判斷被檢擴增片段中是否帶有突變點二、等位基因特異性寡核苷酸二、等位基因特異性寡核苷酸不同順序不同構(gòu)象不同電泳行為三、單鏈構(gòu)象多態(tài)性單鏈