第2章遺傳圖繪制

基因組計(jì)劃基本目標(biāo)是獲得全基因組順序，在此基礎(chǔ)上再對(duì)序列進(jìn)行。獲取基因組順序的主要方法是進(jìn)行DNA測(cè)序，然后再將讀取的順序組裝。目前的DNA測(cè)序每次反應(yīng)僅能讀取不到1000bp的長(zhǎng)度，已知最小的細(xì)菌基因組為580kb。因此基因組測(cè)序的第一步是構(gòu)建基因組圖，然后將基因組區(qū)段分解逐個(gè)測(cè)序，最后進(jìn)行組裝。基因組作圖的基本構(gòu)想是，在長(zhǎng)鏈DNA分子的不同位置尋找特征性的分子標(biāo)記，根據(jù)分子標(biāo)記將包括這些序列的克隆進(jìn)行連鎖定位，繪制基因組圖。一旦構(gòu)建好基因組圖，即可著手進(jìn)入全基因組測(cè)序。以基因組圖指導(dǎo)的測(cè)序有二種可供選擇的路線(圖2.1)：

克隆(clone)定義

一個(gè)共同前體通過(guò)無(wú)性繁殖而形成的一群基因結(jié)構(gòu)相同的細(xì)胞或個(gè)體。(組培)基因克隆，則指一個(gè)基因反復(fù)擴(kuò)增后產(chǎn)生的多個(gè)拷貝。動(dòng)名詞(cloning)即指獲得克隆的過(guò)程或手段。利用體外重組技術(shù)將某特定的基因或DNA序列插入載體分子的操作過(guò)程。

1.重疊克隆群法構(gòu)建過(guò)程：DNA測(cè)序不能從染色體進(jìn)行，首先必須克隆化。先構(gòu)建片段DNA克隆(以YAC或BAC為載體)，并把克隆依染色體排序，這就是“染色體的克隆圖”。依片段DNA克隆在染色體上所在的位置排序，可以得到相互重疊的一系列克隆，叫做“克隆重疊群”(contiguousseriesofoverlappingclones,Contig)。這些重疊克隆群之間往往是有間隙的，需通過(guò)染色體步行(chromosomewalking)的方法將這些克隆群整合在一起。在單個(gè)的重疊群中，采用鳥槍法測(cè)序，然后在重疊群內(nèi)進(jìn)行組裝。這是一種由上至下(uptodown)的測(cè)序策略。2.鳥槍法(shotgunsequencingmethod)將目的DNA隨機(jī)地處理成大小不同的片段，再將這些片段的序列連接起來(lái)的測(cè)序方法。高密度的基因組圖分子標(biāo)記可以檢測(cè)組裝的DNA片段是否處在正確的位置，并校正因重復(fù)順序的干擾產(chǎn)生的序列誤排。這是一種由下至上(bottomtoup)的測(cè)序策略?；蚪M圖的繪制可為基因組的全面測(cè)序提供工作框架。由于一些分子標(biāo)記同基因座位緊密連鎖，同時(shí)為靶基因的定位克隆提供了可能。根據(jù)靶基因所在基因組圖中的位置，可以盡快地獲知重要基因的順序。正是基于這些理由，人類基因組計(jì)劃最初6年的工作重心主要放在人類基因組圖繪制。鳥槍法(shotgunsequencingmethod)2.1遺傳圖與物理圖

根據(jù)采取的方法不同將基因組作圖分為兩個(gè)范疇：

①遺傳作圖(geneticmapping)采用遺傳學(xué)分析方法將基因或其他DNA順序標(biāo)定在染色體上構(gòu)建連鎖圖。這一方法包括雜交實(shí)驗(yàn)和家系分析。遺傳圖距單位為厘摩(cM)，每單位厘摩定義為1%交換率。

②物理作圖(physicalmapping)采用分子生物學(xué)技術(shù)直接將DNA分子標(biāo)記、基因或克隆標(biāo)定在基因組實(shí)際位置。物理圖的距離依作圖方法而異，如輻射雜種(radiationhybrid)作圖的計(jì)算單位為厘鐳(cR)，限制性片段作圖與克隆作圖的圖距單位為DNA的分子長(zhǎng)度，即堿基對(duì)。2.2遺傳作圖標(biāo)記任何一類圖譜都有可識(shí)別的標(biāo)記，以便尋找目標(biāo)的方位及彼此之間的相對(duì)位置。遺傳圖有特征性的位置標(biāo)記用表示基因組中特定順序所在的位置。2.2.1基因標(biāo)記

經(jīng)典遺傳學(xué)研究一種性狀的遺傳必需要求同一性狀至少有二種不同的存在形式或稱表型。如孟德爾研究豌豆植株高與矮這種相對(duì)性狀，每個(gè)相對(duì)性狀都有一個(gè)不同的等位基因(allele)控制。最初人們識(shí)別的指令表型的基因都是通過(guò)肉眼觀察辨認(rèn)的，如果蠅軀體的顏色，翅膀形狀等標(biāo)記都可在低倍顯微鏡下或直接用肉眼進(jìn)行分辨。這些研究雖然在遺傳學(xué)發(fā)展的早期階段取得了很好的結(jié)果，但很快遺傳學(xué)家即意識(shí)到可見的表型性狀數(shù)目十分有限，尤其是當(dāng)多個(gè)基因影響同一性狀時(shí)，遺傳分析往往陷入困境。為了使遺傳圖具有更強(qiáng)的綜合性，必需發(fā)現(xiàn)大量易于區(qū)分的、較為單一的性狀，具有生化特征的表型具備上述要求。微生物如細(xì)菌及酵母遺傳學(xué)研究中，依賴于生化表型的分析，已將一些生化性狀基因進(jìn)行作圖。人類血型系列(ABO)分析，血清蛋白和免疫蛋白(人類白細(xì)胞抗原，HLA)變異研究都是利用生化的表型。這些生化特征較之可見表型的最大優(yōu)點(diǎn)在于：它們屬于多等位基因(multiplealleles)。例如HLA-DRBI(humanleukocyteantigens-DRBI，人類白細(xì)胞抗原DRBI)基因位點(diǎn)有至少59個(gè)等位基因，HLA-B位點(diǎn)至少有60個(gè)等位基因。

2.2.2DNA標(biāo)記雖然基因標(biāo)記非常有用，但并非理想的標(biāo)記。原因之一是，高等生物如脊椎動(dòng)物和顯花植物，可用作標(biāo)記的基因十分有限，許多性狀都涉及多基因。此外高等生物基因組中存在大量的基因間隔區(qū)，純粹用基因作為標(biāo)記將在遺傳圖中留下大片的無(wú)標(biāo)記區(qū)段。還有一個(gè)原因是，只有部分基因其等位基因成員可以通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)予以區(qū)分，因而產(chǎn)生的遺傳圖是不完整的，必需尋找其他更有效的標(biāo)記?；蛑獾淖鲌D工具統(tǒng)稱為DNA標(biāo)記。與基因標(biāo)記一樣，DNA標(biāo)記也必須有等位成員。有三種類型的DNA順序可滿足上述要求：

1.限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphisms，RFLP)

RFLP概念產(chǎn)生于1980年(DavidBostein等)，其基本設(shè)想是，由于同源染色體同一區(qū)段DNA順序的差異，當(dāng)用限制酶處理時(shí)，可產(chǎn)生長(zhǎng)度不同的限制性片段，這些DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，可直接顯示不同個(gè)體同一位點(diǎn)DNA組成的差異(圖2.2)。限制酶識(shí)別的堿基順序有專一性，所以用不的限制酶處理同一DNA樣品時(shí)，可以產(chǎn)生與之對(duì)應(yīng)的不同限制性片段，可提供大量位點(diǎn)多態(tài)性信息。RFLP是第一種被用于作圖研究的DNA標(biāo)記，它們一般有如下特征：①處于染色體上的位置相對(duì)固定；②同一親本及其子代相同位點(diǎn)上的多態(tài)性片段特征不變；③同一凝膠電泳可顯示不同多態(tài)性片段，具有共顯性特點(diǎn)。2.簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性(simplesequencelengthpolymorphisrns，SSLP)SSLP產(chǎn)生于重復(fù)順序的可變排列，同一位點(diǎn)重復(fù)順序的重復(fù)次數(shù)不同，表現(xiàn)出DNA序列的長(zhǎng)度變化。與RFLP不同的是，SSLP具多等位性(multiallelic)，每個(gè)SSLP都有多個(gè)長(zhǎng)度不一的變異體。有兩種類型的SSLP常用于作圖：小衛(wèi)星序列(minisatellite)又稱可變串連重復(fù)(variablenumberoftandemrepeats，VNTR)，其重復(fù)單位的長(zhǎng)度為數(shù)十個(gè)核苷酸。微衛(wèi)星序列(microsatellite)也稱簡(jiǎn)單串連重復(fù)(simpletandemrepeats，STR)，其重復(fù)單位為1-6個(gè)核苷酸，由10-50個(gè)重復(fù)單位串連組成。Beckman等曾計(jì)算過(guò)人類基因組一段745kbDNA中微衛(wèi)星序列的數(shù)目，平均每6kb一個(gè)位點(diǎn)。人類基因組中76%的重復(fù)順序?yàn)锳、AC、AAAN、AAN或AG，豐度依次遞減。作圖中應(yīng)用最廣的重復(fù)順序?yàn)锳G，主要分布在5’和3’非翻譯區(qū)以及內(nèi)含子中。人約80%的A、AAAN、AAN重復(fù)順序以及50%的AT微衛(wèi)星序列位于人類基因組Alu重復(fù)順序的3’端。人的X染色體平均每300-500kb有1個(gè)三核苷酸和1個(gè)四核苷酸微衛(wèi)星序列，因其比二核苷酸微衛(wèi)星序列更易分型(圖2.3)。微衛(wèi)星序列的應(yīng)用比小衛(wèi)星序列的應(yīng)用普遍得多，原因有二：其一，小衛(wèi)星序列在基因組中的分布很不均勻，大多集中在染色體的端部，而微衛(wèi)星序列在整個(gè)基因組中不僅分布廣且密度高；其二，微衛(wèi)星序列便于PCR分析，當(dāng)PCR擴(kuò)增的DNA長(zhǎng)度少于300bp時(shí)，反應(yīng)既快速又精確。小衛(wèi)星序列因其重復(fù)單位較長(zhǎng)，加之許多重復(fù)順序往往串接在單個(gè)順序中，不利于PCR對(duì)樣品的擴(kuò)增。微衛(wèi)星序列的多態(tài)性信息量(polymorphicinformationcontent，PIC)某一標(biāo)記在群體中出現(xiàn)多態(tài)性的頻率。一般大于0.75。大多數(shù)微衛(wèi)星序列均有4個(gè)或更多的等位型，50%以上的家庭其成員均有足夠的微衛(wèi)星序列多態(tài)性信息可供連鎖分析。雖然微衛(wèi)星序列的功能還不清楚，但它卻是遺傳圖與物理圖研究中非常有用的工具。由于微衛(wèi)星變異很大，在同一物種的不同個(gè)體中微衛(wèi)星重復(fù)單位的數(shù)目有廣泛的差異。微衛(wèi)星序列中拷貝數(shù)的變化主要產(chǎn)生于DNA復(fù)制時(shí)出現(xiàn)的“滑序”事件，使重復(fù)單位的拷貝數(shù)增加或減少。這種變異使得人群中任何2人在若干位點(diǎn)微衛(wèi)星的組合幾乎都不相同。假如我們有可能檢測(cè)每個(gè)人的微衛(wèi)星序列，則可編制每個(gè)人獨(dú)有的遺傳檔案(geneticprofile)。

3.單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms，SNP)基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。是人類可遺傳的變異中最常見的一種。占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500-1000個(gè)堿基對(duì)中就有1個(gè)，估計(jì)其總數(shù)可達(dá)300萬(wàn)個(gè)甚至更多?；蚪M中單個(gè)核苷酸的突變稱為點(diǎn)突變，理論上每個(gè)單核苷酸位置最多只有四種形式，即A、T、C和G。某些群體在特定的單核苷酸位置只有2個(gè)或3個(gè)SNP，這些位點(diǎn)稱為雙等位(biallele)或三等位(triallele)(圖2.4)。在基因的編碼順序中，SNP大多位于密碼子的搖擺位置，表現(xiàn)為沉默突變而被大量保留下來(lái)。大多數(shù)SNP所在的位置不能被限制酶識(shí)別，必須采取測(cè)序或寡聚核苷酸雜交檢測(cè)。二倍體細(xì)胞中每個(gè)SNP最多只有2種等位型。與RFLP類似，SNP在同一個(gè)體中常常會(huì)以純合狀態(tài)存在。對(duì)某一特定的SNP，同一家系的成員可能有相同的基因型。盡管如此，SNP仍具有RFLP所不可比擬的其他優(yōu)點(diǎn)，如SNP在基因組中的數(shù)量極大，人群中幾乎任何2個(gè)個(gè)體的基因組都有許多SNP。2.3遺傳作圖的方法

2.3.1孟德爾遺傳學(xué)簡(jiǎn)介遺傳圖繪制主要依據(jù)由孟德爾的遺傳學(xué)原理。他發(fā)現(xiàn)每株豌豆都有2個(gè)等位基因，但只出現(xiàn)一種表型。當(dāng)植株完全自交時(shí)會(huì)產(chǎn)生純合子(homozygous)，它們有2個(gè)相同的等位基因，出現(xiàn)可預(yù)知的表型。孟德爾進(jìn)一步證明，2個(gè)具有不同表型的純合植株雜交，雜種一代所有植株的表型一致。F1代植株為雜合子。它們從其雙親各繼承了一個(gè)等位基因。F1代植株所表現(xiàn)的性狀稱為顯性性狀，未表現(xiàn)的性狀為隱性性狀。孟德爾二條遺傳定律：等位基因隨機(jī)分離，即F1代的每個(gè)成員都有相同的機(jī)會(huì)傳遞A或a等位基因；非等位基因自由組合，即位于不同基因座位的等位基因獨(dú)立遺傳。根據(jù)這二個(gè)定律，一個(gè)雜交試驗(yàn)的結(jié)果是可以預(yù)期的。一個(gè)基因的2個(gè)等位基因在二倍體細(xì)胞中各由2條同源染色體攜帶，它們從親本傳遞給子代是按孟德爾的方式進(jìn)行的，并與二倍體在減數(shù)分裂時(shí)產(chǎn)生單倍體的事件相一致。孟德爾當(dāng)時(shí)只觀察到了簡(jiǎn)單的顯隱性規(guī)律，有些現(xiàn)象未曾遇到。如不完全顯性，即雜合子表現(xiàn)為2個(gè)純合子的中間表型。另一種現(xiàn)象為共顯性，即雜合子同時(shí)出現(xiàn)2個(gè)等位基因的表型。孟德爾對(duì)遺傳學(xué)作出了重大貢獻(xiàn)，但也犯了一個(gè)不小的錯(cuò)誤。因?yàn)榘凑彰系聽柕诙蓪⒉辉试S連鎖(linkage)發(fā)生，實(shí)際上當(dāng)2個(gè)不同的基因位于同一染色體上時(shí)，2個(gè)不同的等位基因?qū)⒐餐z傳。孟德爾的后繼者發(fā)現(xiàn)了連鎖，為遺傳作圖奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。2.3.2連鎖分析

連鎖分析于1905年，分別由Bateson、Saunder和Punnett發(fā)現(xiàn)，但是直到1910-1911年Morgan以果蠅為實(shí)驗(yàn)對(duì)象開始他的經(jīng)典遺傳學(xué)的奠基式工作時(shí)，連鎖分析的重要意義才逐漸被人們所了解。20世紀(jì)初期，遺傳學(xué)家已經(jīng)認(rèn)識(shí)到基因位于染色體上，每條染色體均以完整的單位傳遞。換句話說(shuō)，如果有2個(gè)基因位于同一條染色體上，它們則機(jī)械地連接在一起，共同傳遞給下一代。這種看似確切無(wú)疑的假說(shuō)隨后發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)情況下并不符合觀測(cè)到的試驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)遺傳學(xué)家采用類似孟德爾早期豌豆雜交的方法觀察子代的性狀分離時(shí)發(fā)現(xiàn)，原先認(rèn)為位于同一染色體上的基因，只有極少數(shù)是完全連鎖的。這些被觀察的成對(duì)基因要么顯示獨(dú)立遺傳，要么表現(xiàn)部分連鎖，或者說(shuō)他們時(shí)而共同傳遞，時(shí)而分道揚(yáng)鑣。正是這種理論預(yù)期與實(shí)際結(jié)果的矛盾孕育著遺傳學(xué)上的重大突破，由此而誕生了一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)——遺傳連鎖作圖。

減數(shù)分裂時(shí)期染色體的行為解釋了為何同一染色體上的基因表現(xiàn)為部分而非完全連鎖現(xiàn)象。摩爾根對(duì)遺傳學(xué)的重大貢獻(xiàn)在于，他從基因的部分連鎖與細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)染色體行為之間的關(guān)系中領(lǐng)悟到其間的內(nèi)在聯(lián)系，從而在觀念上產(chǎn)生了飛躍。19世紀(jì)后期，細(xì)胞學(xué)家已能區(qū)分二種細(xì)胞分裂類型：有絲分裂與減數(shù)分裂。有絲分裂主要發(fā)生在體細(xì)胞的二倍體細(xì)胞核中，由此產(chǎn)生的子細(xì)胞均從母細(xì)胞獲得同等的遺傳物質(zhì)。人的一生中要經(jīng)歷大約1017次有絲分裂產(chǎn)生所需的體細(xì)胞。有絲分裂開始前，每條染色體在細(xì)胞核中復(fù)制，復(fù)制的染色體并不馬上彼此分開，而是附著在著絲粒上。直到有絲分裂的晚期，復(fù)制的染色體才均等地分離形成二個(gè)新的子代細(xì)胞核。

有絲分裂細(xì)胞核中所發(fā)生的事件與遺傳作圖并無(wú)直接關(guān)連，我們感興趣的只在減數(shù)分裂。減數(shù)分裂只發(fā)生在生殖細(xì)胞中，二倍體母細(xì)胞產(chǎn)生4個(gè)單倍體配子，每個(gè)配子在有性生殖時(shí)與來(lái)自另一性別的配子融合，恢復(fù)到原來(lái)親代的染色體倍數(shù)。有絲分裂與減數(shù)分裂的相同之處在于，每條染色體都必須經(jīng)歷1次復(fù)制；不同之處是，有絲分裂的細(xì)胞只發(fā)生1次分裂，而減數(shù)分裂的細(xì)胞則發(fā)生連續(xù)2次細(xì)胞分裂。第二次細(xì)胞分裂時(shí)，染色體數(shù)目減半。有絲分裂與減數(shù)分裂的另一個(gè)更為關(guān)鍵的差別是姐妹染色體變換。二倍體細(xì)胞中每條染色體都有2份拷貝，這2份拷貝稱之為同源染色體。有絲分裂中，同源染色體的2份拷貝分別獨(dú)立復(fù)制，然后彼此分離進(jìn)入子細(xì)胞。減數(shù)分裂時(shí)，成對(duì)同源染色體并非獨(dú)立行動(dòng)。在減數(shù)分裂I期，每條同源染色體復(fù)制后并不馬上分開。攜帶2份拷貝的同源染色體彼此靠攏，同源區(qū)段并排形成雙價(jià)體(bivalent)。在雙價(jià)體中，并列的同源染色體臂(染色單體)會(huì)發(fā)生機(jī)械斷裂，彼此交換DNA區(qū)段，這一過(guò)程被稱為交換(crossing-over)或重組(recombination)。同源染色體的交換由比利時(shí)細(xì)胞學(xué)家Janssens于1909年發(fā)現(xiàn)，2年后摩爾根開始思考他的部分連鎖問(wèn)題。交換的發(fā)現(xiàn)如何幫助摩爾根解釋部分連鎖問(wèn)題呢？我們先來(lái)考查染色體交換對(duì)基因傳遞方式的影響。假定有二個(gè)位于果蠅2號(hào)染色體上的基因分別為A和B，它們都有2個(gè)等位基因，即A與a，B與b?，F(xiàn)在我們跟蹤這2對(duì)基因在減數(shù)分裂時(shí)如何分布到配子中，這里有兩種方案可供選擇(圖2.5)：①A與B位點(diǎn)之間不發(fā)生交換。如果發(fā)生這種情況，只有二種配了產(chǎn)生，一種攜帶A與B基因，另一種只攜帶a與b。②A與B之間發(fā)生交換。這將導(dǎo)致一段攜帶B基因的染色體區(qū)段與攜帶b基因的同源染色體區(qū)段相互交換，由此產(chǎn)生4種配子類型，即1AB、laB、1Ab和lab。

假定有100個(gè)相同的減數(shù)分裂細(xì)胞，在不發(fā)生交換時(shí)產(chǎn)生下列數(shù)目的基因型配子：200AB200ab這是完全連鎖的結(jié)果：基因A與B的行為在減數(shù)分裂時(shí)類似一個(gè)整體。如果在某些減數(shù)分裂細(xì)胞中發(fā)生交換，這2對(duì)等位基因成員的傳遞將不是作為一個(gè)單位。假定100個(gè)減數(shù)分裂事件中，有40個(gè)發(fā)生變換，將產(chǎn)生下列配子：160AB160ab40Ab40aB這種連鎖是不完全的，或者說(shuō)是部分的，因?yàn)樵诋a(chǎn)生的配子中出現(xiàn)了新的連鎖形式，即Ab與aB。部分連鎖與遺傳作圖

當(dāng)摩爾根認(rèn)識(shí)到部分連鎖可以通過(guò)堿數(shù)分裂中的交換給予解釋，他即考慮如何設(shè)計(jì)一種方法來(lái)確定基因在染色體上的位置。關(guān)鍵的突破并不是摩爾根本人，而是他的一位研究生——ArthurSturtevant。Sturtevant設(shè)想如果交換是隨機(jī)發(fā)生的話，那么一對(duì)并列的染色單體上任何位點(diǎn)發(fā)生交換的機(jī)會(huì)部是均等的。似如這種設(shè)想是正確的，那么2個(gè)彼此靠近的基因之間因交換而分離的頻率要比相互遠(yuǎn)離的2個(gè)基因之間發(fā)生分離的頻率要小?；蛘哒f(shuō)，因交換使2個(gè)連鎖基因分開的頻率應(yīng)同它們?cè)谌旧w上所處位置的距離成正比，而重組率(recombinationfrequency)則可成為測(cè)量基因之間相對(duì)距離的尺度。只要獲得不同基因之間的重組率，就可繪制一份基因位于染色體上相對(duì)位置的地理圖(圖2.6)。遺傳圖的偏離

Sturtevant關(guān)于隨機(jī)變換的設(shè)想極富創(chuàng)見但不完全正確。大量細(xì)胞遺傳學(xué)的研究表明，染色體的各個(gè)區(qū)段交換頻率有很大差別。例如，近端粒區(qū)和遠(yuǎn)著絲粒區(qū)有較高的重組率。染色體的某些位點(diǎn)之間比其他位點(diǎn)之間有更高的交換頻率，被稱為重組熱點(diǎn)(recombinationhotspot)。如老鼠主要組織兼容性復(fù)合座位(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)含有一組控制免疫反應(yīng)的基因，其中有一個(gè)區(qū)段的重組率高于平均數(shù)數(shù)百倍。這一熱點(diǎn)引發(fā)的所有重組事件均發(fā)生在基因Eb的第二個(gè)內(nèi)含子中，長(zhǎng)度為4.3kb。在這一熱點(diǎn)區(qū)還檢測(cè)到一個(gè)9/11核苷酸一致順序，即5’-TGGAAATCCCC-3’，這一順序在其他重組熱點(diǎn)中亦已發(fā)現(xiàn)。除上述造成遺傳圖偏離的現(xiàn)象之外，性別之間也會(huì)表現(xiàn)重組率的差異。圖2.7所示為人類1號(hào)染色體一個(gè)區(qū)段的遺傳圖，男性與女性之間染色體交換頻率在同一位點(diǎn)彼此相異，各有一個(gè)性別專一性重組熱點(diǎn)。就一般規(guī)律而言，由女性減數(shù)分裂事件繪制的遺傳圖比男性減數(shù)分裂事件繪制的遺傳圖長(zhǎng)得多(表2.1)。

連鎖分析時(shí)，還會(huì)遇到同一染色單體發(fā)生多起交換的現(xiàn)象。當(dāng)多起變換發(fā)生在二個(gè)基因之間時(shí)，會(huì)產(chǎn)生距離減少的假象。盡管遺傳圖存在以上一些偏差，但連鎖分析給出的遺傳標(biāo)記在染色體上的排列次序是相當(dāng)準(zhǔn)確的，也提供了基因間的大致距離，它們?yōu)榛蚪M測(cè)序計(jì)劃提供了極有價(jià)值的工作框架。

2.3.3不同模式生物的連鎖分析

減數(shù)分裂重組率的分析只適用于有性生殖的生物，缺少有性生活史的生物必須采取其他作圖策略構(gòu)建連鎖圖。由于倫理學(xué)的問(wèn)題，有計(jì)劃的雜交試驗(yàn)不適用于人類。此外有些生物因妊娠期過(guò)長(zhǎng)以及從出生到成熟要渡過(guò)很長(zhǎng)時(shí)期也限制了這一方法的應(yīng)用，因此必須尋找可替代的作圖方式。根據(jù)資料收集的方法，可將連鎖分析分為三大范疇：

①有性雜交實(shí)驗(yàn)根據(jù)需要有計(jì)劃地實(shí)施雜交方案進(jìn)行連鎖分析，如果蠅、老鼠以及玉米、水稻等動(dòng)植物的遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)。

②系譜分析不能進(jìn)行有計(jì)劃的遺傳試驗(yàn)，只能收集家系成員的相關(guān)資料進(jìn)行連鎖分析，主要涉及人類以及多年生的樹木等。

③DNA轉(zhuǎn)移不發(fā)生減數(shù)分裂的生物，如細(xì)菌與病毒基因組的連鎖分析。

雜交試驗(yàn)的連鎖分析摩爾根進(jìn)行的連鎖分析都是人為控制的模式生物的有性雜交。這一方法的基本程序大都相同，即首先選擇已知基因型的親本，設(shè)計(jì)雜交方案，獲得交配的子代并分析其表型及基因型。兩點(diǎn)雜交基因作圖的關(guān)鍵在于確定減數(shù)分裂產(chǎn)生的配子基因型。少數(shù)情況下，配子的基因型可直接分辨，如啤酒酵母有配子體世代，在特定培養(yǎng)基上能直接檢測(cè)其生化基因型。當(dāng)某些真核生物的精細(xì)胞經(jīng)PCR放大獲得足夠DNA分子時(shí)，亦可直接用RFLP、SSLP和SNP測(cè)定其基進(jìn)因型，但這一方法實(shí)際操作有很大困難。常規(guī)的真核生物連鎖分析并非直接檢測(cè)配子的基因型，而是通過(guò)試驗(yàn)確定二種配子融合產(chǎn)生的二倍體子代基因型，即遺傳雜交試驗(yàn)。遺傳雜交試驗(yàn)產(chǎn)生的二倍體子代不是一種(單性)減數(shù)分裂的產(chǎn)物，而是二種(雙性)減數(shù)分裂配子的融合。大多數(shù)生物所產(chǎn)生的雌雄配子都會(huì)發(fā)生機(jī)率大體一致的交換。我們的目的必須從二倍體子代基因型中分清哪些變換事件來(lái)自父親，哪些來(lái)自母親。為了便于檢測(cè)，常用測(cè)交(testcross)方法分析子代基因型的分離比，并由此推測(cè)親代細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)同源染色體的交換頻率。多點(diǎn)雜交1條染色體上有許多連鎖的基因，這些基因所在的位置及其相對(duì)排列次序可由多點(diǎn)雜交分析確定。單雜交只能確定2個(gè)位點(diǎn)是否連鎖及其連鎖的程序，當(dāng)涉及第3個(gè)位點(diǎn)時(shí)，必須采用雙雜交的方法檢測(cè)其連鎖關(guān)系及連鎖程度。雙雜交與單雜交略有不同。假定有3個(gè)基田座位A、B和C，等位基因?yàn)閍、b和c。一個(gè)親本基因型為三位點(diǎn)雜合子，另一親本為三位點(diǎn)純合子?？梢灶A(yù)期測(cè)交子代中比例最高的基因型為雙親基因型，其次是A與B或C，B與A或C之間發(fā)生的交換；最少的基因型是在A與C和B與C之間同時(shí)發(fā)生交換的基因型。第二類重組事件(表中51個(gè)和63個(gè)子代)可假定產(chǎn)生于一次單變換。從51個(gè)子代的重組事件可推測(cè)，A座位與B和C之間已發(fā)生重組，而63個(gè)子代重組事件產(chǎn)生于B與A和C之間的重組。這說(shuō)明A與B座位應(yīng)位于兩側(cè)，而C處在A與B之間。這一點(diǎn)可由C座位與A和B之間發(fā)生重組所產(chǎn)生的子代數(shù)目證實(shí)，因?yàn)橹挥蠥與C，和C與B之間發(fā)生雙交換才能出現(xiàn)這一基因型(表2.2)。RFLP連鎖圖

以性狀作為標(biāo)記的作圖方法有很大的局限，除了可供選擇的標(biāo)記數(shù)量不多之外，二倍體生物的表型都有顯性與隱性的區(qū)別。因此要獲得隱性性狀的分離比，必須得到基因型純合的個(gè)體。在實(shí)際操作過(guò)程中，只有通過(guò)下一代個(gè)體性狀的分離才可推測(cè)上一代的基因型組成。DNA分子標(biāo)記不以表型為參照，直接檢測(cè)個(gè)體基因型的組成，具有共顯性的特點(diǎn)，因此可提供當(dāng)代個(gè)體基因型分離比。RFLP是最早用于構(gòu)建基因組遺傳圖的分子標(biāo)記，目前仍被廣泛采用。以DNA分子標(biāo)記構(gòu)建遺傳圖的操作程序與經(jīng)典的遺傳作圖類似，只是統(tǒng)計(jì)的性狀改為DNA標(biāo)記。圖2.8描述了一般的RFLP連鎖圖繪制的過(guò)程。已知在同一連鎖群上有2個(gè)座位分別為A和B，親本P1和親本P2在A和B座位分別有一對(duì)DNA標(biāo)記Al和A2、B1和B2，在凝膠電泳中A1、A2、B1和B2有特征性的遷移圖譜。DNA標(biāo)記可在親子代中穩(wěn)定遺傳，因此A1、A2、B1和B2在上下代的遷移位置是不變的。當(dāng)P1與P2雜交后，F(xiàn)1代具有兩個(gè)親本共有的DNA標(biāo)記電泳圖。F1代自交后，如果在A與B座位間發(fā)生交換，將會(huì)出現(xiàn)4種DNA標(biāo)記電泳圖：2種與親本相同，另外2種為新的組合，即A1/B2和A2/B1。凝膠電泳中除親本外每一泳道代表的均為F2代個(gè)體，RFLP的電泳圖表示不同個(gè)體的基因型。假定F2代具有親本基因型的個(gè)體為231，重組基因型A1/B2+A2/B1為39。由計(jì)算得知座位A與B之間的交換率應(yīng)為39/(231+39)=14%，即A與B相距14cM?；蚪MRFLP連鎖圖的密度與DNA分子標(biāo)記的來(lái)源有關(guān)。在基因組計(jì)劃的早期，可用的分子標(biāo)記非常有限，因而繪制的連鎖圖間隙很大。隨著分子標(biāo)記的增加，標(biāo)定位點(diǎn)的之間的圖距逐漸減少，如水稻基因組連鎖圖已定位的分子標(biāo)記超過(guò)2000，每個(gè)cM平均含有1個(gè)標(biāo)記。基因與分子標(biāo)記的共分離傳統(tǒng)的遺傳連鎖圖定位只能給出某一基因所在染色體上的大致位置，并且這種位置只是抽象的，據(jù)此我們無(wú)法克隆真實(shí)的基因。RFLP連鎖圖的建立使我們有可能借助分子標(biāo)記共分離試驗(yàn)，找到基因所在的確切位置，并為靶基因克隆奠定基礎(chǔ)。假如基因附近有一個(gè)緊密連鎖的分子標(biāo)記，在細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)分子標(biāo)記與基因之間由于相距太近很少有機(jī)會(huì)發(fā)生變換。在有性繁殖的后代，這種分子標(biāo)記與連鎖的基因有最大的可能同時(shí)出現(xiàn)在同一個(gè)體中，這一現(xiàn)象被稱為共分離。尋找與靶基因共分離的分子標(biāo)記是圖位克隆(map-basedcloning)的一個(gè)關(guān)鍵步驟，這是一個(gè)逐步推進(jìn)的過(guò)程。首先可從RFLP框架連鎖圖中找到與靶基因位于同一連鎖群的分子標(biāo)記，然后再?gòu)耐贿B鎖群的分子標(biāo)記中檢測(cè)與靶基因接近的分子標(biāo)記，依次漸進(jìn)，直至獲得最接近基因座位的標(biāo)記為止(圖2.9)。

系譜分析作圖人們不可能為特定的作圖目的預(yù)先選擇父母的基因型來(lái)設(shè)計(jì)人類遺傳學(xué)試驗(yàn)，人類基因重組頻率的計(jì)算只有通過(guò)檢測(cè)現(xiàn)有家系連續(xù)世代成員基因型才能獲得。這意味著只能獲取有限的數(shù)據(jù)，難以對(duì)結(jié)果給予滿意的解釋。特別是人類的婚配不可能像遺傳學(xué)上的測(cè)交那樣預(yù)先設(shè)計(jì)，加上家族成員有的已經(jīng)去世，有的不愿配合，更增加了基因型分析的困難。為此人們?cè)O(shè)計(jì)了一種稱為系譜分析的方法用以繪制人類遺傳圖，在獲得相應(yīng)的RFLP標(biāo)記后，可采用類似程序構(gòu)建RFLP連鎖圖(圖2.10)。

由于系譜分析所能提供的樣品非常有限，因此必須借助統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行可信度檢驗(yàn)，常用的程序?yàn)閘od值(lodscore，優(yōu)勢(shì)值)評(píng)價(jià)。lod值是基因連鎖可能性的對(duì)數(shù)，用于初步判斷所研究的2個(gè)基因是否位于同一染色體上。換句話說(shuō)，可以回答2個(gè)基因是否連鎖。如果lod分析確定是連鎖的，然后可以提供最可能的重組頻率的程度。理想的情況是，現(xiàn)有的資料來(lái)自1個(gè)以上的家系，由此增加結(jié)果的可信度。為了繪制一份詳細(xì)的人類基因組遺傳連鎖圖，巴黎的人類多樣性中心(Centred'EtudeduPolymorphismHumaine，CEPH)收集與保留了許多這類樣品，包括一些家系的培養(yǎng)細(xì)胞系。研究者只要同意將獲得的結(jié)果告訴CEPH的資料中心，即可從CEPH處獲取樣品用于DNA標(biāo)記作圖。

細(xì)菌的遺傳作圖細(xì)菌基因組的遺傳作圖面臨的主要困難在于，這類生物一般都是單倍體，不發(fā)生減數(shù)分裂，因此必需設(shè)計(jì)一些方法使細(xì)菌DNA的同源區(qū)段發(fā)生交換。解決的辦法有三種，它們都涉及到使DNA片段從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞(圖2.11)：

①轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)以噬菌體為媒介，將長(zhǎng)度可達(dá)50kb的DNA片段從供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞。

②轉(zhuǎn)化(transformation)供體細(xì)胞釋放的一段DNA