轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)飛魚2011-12-5轉(zhuǎn)基因技術(shù)1雙擊添加標題文字定義與原理常用方法23研究前景與運用1定義轉(zhuǎn)基因技術(shù)：將人工分離和修飾過的基因?qū)氲缴矬w基因組中，由于導入基因的表達，引起生物體的性狀的可遺傳的變化，這一技術(shù)稱之為轉(zhuǎn)基因技術(shù)（Transgenetechnology）。重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNA

cDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定分子雜交目錄(插入失活法)抗藥性標記選擇目錄原位雜交目錄常用的植物轉(zhuǎn)基因方法遺傳轉(zhuǎn)化的方法按其是否需要通過組織培養(yǎng)、再生植株可分成兩大類:1、需要通過組織培養(yǎng)再生植株，常用的方法有農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法、基因槍法；2、不需要通過組織培養(yǎng)，目前比較成熟的主要有花粉管通道法。常用的動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)1．核顯微注射法2．精子介導的基因轉(zhuǎn)移3．核移植轉(zhuǎn)基因法4．體細胞核移植法過去的幾千年里農(nóng)作物改良的方式主要是對自然突變產(chǎn)生的優(yōu)良基因和重組體的選擇和利用，通過隨機和自然的方式來積累優(yōu)良基因。遺傳學創(chuàng)立后近百年的動植物育種則是采用人工雜交的方法，進行優(yōu)良基因的重組和外源基因的導入而實現(xiàn)遺傳改良。因此，轉(zhuǎn)基因技術(shù)與傳統(tǒng)技術(shù)是一脈相承的，其本質(zhì)都是通過獲得優(yōu)良基因進行遺傳改良。植物：抗蟲、抗病、抗除草劑植物培育、改良作物品質(zhì)（富含賴氨酸的玉米）動物：提高生長速度、生產(chǎn)藥物蛋白、器官移植、乳腺生物反應器微生物：疫苗基因治療，生物治療，基因診斷，疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆、遺傳病的預防應用基因敲除(knock-out)雙擊添加標題文字定義方法23現(xiàn)狀1利用基因同源重組進行基因敲除發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrecombination)，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。同源重組需要一些重組蛋白和酶，如RecA、B、C、D及DNA連接酶等最為廣泛Holliday模型中，同源重組主要4個關(guān)鍵步驟：①兩個同源染色體DNA排列整齊②一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應的鏈連接，形成Holliday中間體③通過分支移動產(chǎn)生異源雙鏈DNA④Holliday中間體切開并修復，形成兩個雙鏈重組體DNA，分別為：

內(nèi)切酶

(recBCD)DNA侵擾(recA)分支遷移

(recA)

內(nèi)切酶(recBCD)

DNA

連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′RNA干擾引起的基因敲除利用隨機插入突變進行基因敲除即基因捕獲法：利用某些能隨機插入基因序列的病毒，細菌或其他基因載體，在目標細胞基因組中進行隨機插入突變，建立一個攜帶隨機插入突變的細胞庫，然后通過相應的標記進行篩選獲得相應的基因敲除細胞。文獻講解技術(shù)原理：同源重組的基因敲除實驗目的：用胚胎干細胞為基礎的基因打靶技術(shù)方法，構(gòu)建基因敲除（p53）的大鼠模型。位于10號染色體上，包括10個外顯子，其中啟動子外顯子2上6.7kb1.6kbdarkagouti(DA)ratES-cellgenomicDNAPositiveselectionnegativeselectionPGK-DTA(磷酸甘油酸激酶1-白喉毒素-A鏈)不參與同源重組，它的隨機插入是為了減少含有隨機目標媒介插入的耐抗生素型ES細胞，以富集正確的目標細胞。DAc8-p53-1EScell79blastocysts（囊胚）顯微注射嵌合體pseudo-pregnantfemaleSprague–Dawleyrats轉(zhuǎn)移Twenty-fourlive-bornpups10malepups6femalepupscollectedfromE4.5Fischer344(F344)ratsfemaleSprague–Dawleyrats交配over600offspringonecarriedtheDAratES-cellgenomeidentifiedbytheappearanceofagouticoatcolour產(chǎn)24只幼鼠，其中10只公鼠和6只母鼠被著色，說明存在DAc8-p53-1。PCRgenotypingresultsshowedthatthisgermlineanimaldidnotinheritthegene-targetedp53alleleFailureofmouseEScellschromosomalabnormalitiesinEScellsover65%ofthecellswerepolyploid（多倍體）DAc8-p53-1EScell染色體組型分析whethergermlinecompetencyofDAc8-p53-1ratEScellscouldbeimprovedthroughsubcloningAround10%ofthecellsformedroundandcompactcoloniesidentified2subcloneswitheuploidchromosomenumbers擴增建立亞克隆inheritancethegene-target