醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實驗

基本技術(shù)

金光輝、李煒、鄭紅花、宋剛、石松林、劉迎福章喻軍、林筱MolecularBiologyTimelineDNAdiscoveredbyF.Meischer18691910Genesonchromosomes;T.H.Morgan1941Onegene-oneenzyme,Beadle&Tatum1944DNAisgeneticmaterial;Avery,Mcleod&McCarty1953StructureofDNA;Watson,Crick,Franklin,Wilkins1961DiscoveryofmRNA;Brenner,Jacob&Meseleson1966Finishedunravelingthecode;Nirenberg&Khorana1972RecombinantDNAmadeinvitro;P.Berg1973DNAclonedonaplasmid;H.Boyer&S.CohenDiscoveryofreversetranscriptase;H.Temin19731977RapidDNAsequencing;F.Sanger&W.Gilbert1977Discoveryofsplitgenes;Sharp,Robertsetal.1982Discoveryofribozymes;T.Cech&S.Altman20011986CreationofPCR;K.Mullisetal.HumanGenomeProject;Venter,Collinsandmanyothers目的和要求通過分子生物學(xué)實驗課程的學(xué)習(xí)和訓(xùn)練，掌握該領(lǐng)域的基本知識、基本技能和基本方法;了解分子生物學(xué)這一新興基礎(chǔ)學(xué)科的研究發(fā)展、技術(shù)革新和最新成果;對分子生物學(xué)的研究領(lǐng)域、研究方法、臨床應(yīng)用等有完整的認識;為今后從事科學(xué)研究和醫(yī)學(xué)工作奠定基礎(chǔ)。掌握實驗操作中常用儀器的使用和工作原理；學(xué)會研究中實驗方法的選擇、原理和操作；學(xué)會實驗資料的收集、整理和；實驗數(shù)據(jù)的處理；學(xué)會對實驗結(jié)果的分析、整理和實驗報告的正確書寫；了解最新研究動向和技術(shù)。通過實驗課程的學(xué)習(xí)加深對分子生物學(xué)理論知識的理解，提高科學(xué)思維能力和分析問題、動手解決問題的能力，培養(yǎng)嚴謹扎實的科研作風(fēng)。實驗操作及實驗報告要求一、實驗操作要求1．實驗課前預(yù)習(xí)實驗內(nèi)容，熟悉實驗?zāi)康?、實驗原理、操作步驟以及實驗注意事項。2．實驗過程中嚴謹操作、仔細觀察、認真實驗并進行實驗記錄。3．準確認真完整清楚記錄實驗現(xiàn)象、實驗結(jié)果和數(shù)據(jù)。實驗記錄需使用專用記錄本，不可使用單片紙或草稿記錄。4．必須掌握操作步驟和實驗流程后才能進行實驗。二、實驗報告要求1．實驗結(jié)束后，應(yīng)及時整理和總結(jié)實驗結(jié)果，寫出實驗報告。實驗報告要求語言準確精煉、表述流暢。2．實驗報告嚴格按照如下格式和內(nèi)容書寫。實驗編號實驗名稱實驗人、學(xué)號、實驗組員、實驗日期實驗?zāi)康膶嶒炘韺嶒灢牧戏椒ê筒襟E實驗結(jié)果結(jié)果討論和結(jié)論

實驗思考題3．在寫實驗報告時，實驗?zāi)康暮驮響?yīng)按照該次實驗內(nèi)容和實驗步驟寫出，要明確具體、有針對性。實驗材料包括實驗所用的實驗動物、細胞或組織、重要的實驗試劑和儀器設(shè)備。實驗結(jié)果中應(yīng)包括全部實驗過程中觀察到的現(xiàn)象、實驗結(jié)果和實驗數(shù)據(jù)。實驗數(shù)據(jù)中的圖表要有圖名和表名，圖名位于圖下方，表名位于表格上方。圖表需大小合適、標注清楚。圖表內(nèi)容和所包含的信息必須在實驗結(jié)果中使用流暢簡潔語言表達出來。結(jié)果討論和結(jié)論是對實驗過程、實驗方法步驟的關(guān)鍵環(huán)節(jié)、實驗設(shè)計的認識體會、實驗結(jié)果、實驗異?，F(xiàn)象、實驗思考題的分析和對該次實驗作出的總結(jié)和結(jié)論。分子生物學(xué)實驗進程實驗一真核細胞染色體DNA的分離制備DNA樣品的純化、定量和電泳檢測實驗二大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化實驗三堿變性法小量制備質(zhì)粒DNA的限制性酶切實驗四瓊脂糖凝膠中DNA片段的分離和回收質(zhì)粒DNA的連接和轉(zhuǎn)化實驗五真核細胞RNA的制備和逆轉(zhuǎn)錄PCR實驗六Western印跡（上）實驗七Western印跡（下）實驗八外源基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達和檢測實驗九多聚酶鏈式反應(yīng)（PCR）反應(yīng)實驗十Northern印跡實驗十一Southern印跡考試生物技術(shù)（biotechnology):

基因工程、細胞工程、發(fā)酵工程、蛋白質(zhì)工程和酶工程，新生物技術(shù)的核心是基因工程技術(shù)。新技術(shù)：基因操作技術(shù)、生物治療技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動植物技術(shù)、人類和其他生命體基因組工程、基因治療技術(shù)、蛋白質(zhì)工程技術(shù)、生物信息技術(shù)、生物芯片技術(shù)等。生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)：基因藥物、重組疫苗、生物芯片、生物反應(yīng)器、基因工程抗體、基因治療與細胞治療、組織工程、轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物、獸用生物制品、生物技術(shù)飼料、胚胎移植工程、基因工程微生物農(nóng)藥、環(huán)保、海洋生物技術(shù)，以及現(xiàn)代生物技術(shù)對發(fā)酵、制藥、輕工食品等傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)的改造等領(lǐng)域。生物技術(shù)在世界各國已經(jīng)或正在成為新的產(chǎn)業(yè)生長點。上游技術(shù)（upstream）——基因工程重組子的構(gòu)建工程菌的構(gòu)建及高效表達基因工程上游技術(shù)基本過程

選擇載體獲得目的基因目的基因與載體的重組重組載體的轉(zhuǎn)化重組子的篩選與鑒定克?。╟lone）:是指通過無性繁殖過程所產(chǎn)生的與親代完全相同的子代群體?；蚩寺。╣enecloning）:指把一個生物體中的遺傳信息（基因片段）通過無性繁殖轉(zhuǎn)人另一個生物體內(nèi)的過程。通過基因克隆可以得到一群完全相同的基因片段，由于基因就是DNA分子，所以也稱其為DNA克隆?；蚩寺〖夹g(shù):

包括基因的獲取、基因的重組、基因的克隆化和基因的表達等。DNA嵌合體（DNAchimera）：內(nèi)、外源DNA插入載體分子所形成的雜合分子（嵌合DNA）。重組（recombination）：構(gòu)建DNA嵌合體分子（重組子）的過程?；蛑亟M（generecombination）:是將不同基因片段連接起來構(gòu)成一個新的DNA分子的過程。分子克隆（molecularcloning）：重組體分子的無性繁殖過程?；蚬こ蹋╣eneticengineering）、又稱為DNA重組技術(shù)（recombinantDNAtechnique）或分子克?。╩olecularcloning）:特定基因（被稱為目的基因或外源DNA片段）的制備、分離、鑒定、改造及其在不同生物間的轉(zhuǎn)移等多項技術(shù)?；虿僮鳎╣enemanipulating）:指所有涉及到DNA或者RNA操作的技術(shù)，或者指所有基因工程和基因工程相關(guān)技術(shù)。分子生物學(xué)實驗基本技術(shù)核酸純化技術(shù)離心分離技術(shù)凝膠電泳技術(shù)核酸定量技術(shù)分子雜交技術(shù)序列分析技術(shù)蛋白表達檢測純化技術(shù)………………原理

1.

核酸混合物成分:

結(jié)構(gòu)類：細胞碎片、細胞器、其他大分子：DNA、RNA、Protein、糖類、脂類等小分子：氨基酸、小分子糖類和脂類、水、無機物等

2.關(guān)鍵:DNA、RNA、Protein3.方案:Protein變性

苯酚：強變性25

氯仿：弱變性24

異戊醇：消泡分層1方法樣品＋等體積飽和苯酚10kb以上輕柔混勻；10kb以下振蕩離心（12000×g）取上清核酸相Protein變性相有機相二、離心技術(shù)原理離心力：

F=ω2r

RCF=F/g=ω2r/g=（2π×N）2r/g=1.119×10-5(N)2rg:重力常數(shù)（980cm/s2）

N:轉(zhuǎn)速（rpm，revolationperminute)N=1000（RCF/11.19r）1/2浮力：K=m-mρ0/ρ(M:物質(zhì)質(zhì)量，ρ：物體密度，ρ0：介質(zhì)密度）沉降阻力：f·(dx/dt)（f:摩擦系數(shù)，x：沉降速度，t：沉降時間）RCF=k+f·(dx/dt)差速離心—密度梯度離心三、凝膠電泳技術(shù)

概論

帶電荷的物質(zhì)在電場中的趨向運動稱為電泳.1937年首創(chuàng)紙電泳技術(shù)后，電泳的種類和應(yīng)用在深度和廣度兩方面均迅速發(fā)展，已成為分子生物學(xué)技術(shù)中分離生物大分子的重要手段。其中，凝膠電泳由于其操作簡單、快速、靈敏等優(yōu)點，使它成為分離、鑒定和提純核酸的首選的標準方法。

等電點：DNApI=6.0-7.0

支持介質(zhì)：瓊脂糖、PA

分離范圍：agarose：100bp～60kbPA：5～500bpF=q×EF’=6πrηνF=F’,ν=q?E/(6πrη)

泳動率（電泳遷移率）：單位電場強度的泳動速度

U=ν/E=q/(6πrη)=(d/t)/(V/L)（cm2/V?S）遷移率單位：10-5（cm2/V?S）球形質(zhì)點的遷移率，首先取決于自身狀態(tài)，即與所帶電量成正比，與其半徑及介質(zhì)粘度成反比。除了自身狀態(tài)的因素外，電泳體系中其它因素也影響質(zhì)點的電泳遷移率。電泳影響因素1.樣品DNA物理性質(zhì)

質(zhì)粒構(gòu)象：CC＞L＞OC

線形：㏒10M正比1/U(U:泳動率）

2.介質(zhì)性質(zhì)

㏒10U=㏒10U0-KrTU：泳動率；U0：自由泳動率；Kr：介質(zhì)阻滯系數(shù)；

T：凝膠濃度。

3.電壓：5v/cm,電場強度：V/L4.緩沖液離子強度：0.02～0.2(I＝(ΣCZn)/2）

C：溶液mol濃度；Z：化合價；n：原子數(shù)目。

TAE、TBE、TPE5.電滲

在電場作用下液體對于固體支持物的相對移動稱為電滲（electro-osmosis）。其產(chǎn)生的原因是固體支持物多孔，且?guī)в锌山怆x的化學(xué)基團，因此常吸附溶液中的正離子或負離子，使溶液相對帶負電或正電。如以濾紙作支持物時，紙上纖維素吸附OH-帶負電荷，與紙接觸的水溶液因產(chǎn)生H3O+，帶正電荷移向負極，若質(zhì)點原來在電場中移向負極，結(jié)果質(zhì)點的表現(xiàn)速度比其固有速度要快，若質(zhì)點原來移向正極，表現(xiàn)速度比其固有速度要慢，可見應(yīng)盡可能選擇低電滲作用的支持物以減少電滲的影響。瓊脂糖凝膠濃度與線形DNA的最佳分辨范圍

瓊脂糖凝膠濃度線形DNA的最佳分辨范圍（bp）0.5%1,000～30,0000.7%800～12,0001.0%500～10,0001.2%400～7,0001.5%200～3,0002.0%50～2,000DNA片段長度Agarose濃度使用Marker種類200bp以下3%以上DNAMarkerDL2,000

DNAMarkerDL2,000+15,000

100bpDNALadderMarker200bp～700bp2%～3%DNAMarkerDL2,000

DNAMarkerDL2,000+15,000

100bpDNALadderMarker700bp～1,500bp1%～2%λ-EcoT14Idigest

DNAMarkerDL2,000

DNAMarkerDL2,000+15,000

100bpDNALadderMarker1,500bp～5,000bp0.7%～1%λ-EcoT14Idigest

λHindIIIdigest

DNAMarkerDL15,000

DNAMarkerDL2,000+15,0005,000bp以上0.7%以下λ-EcoT14Idigest

λHindIIIdigest

DNAMarkerDL15,000

DNAMarkerDL2,000+15,000四、核酸定量技術(shù)原理A=㏒10（1/T）=-log(I/I0)=abca：消光系數(shù)、c：物質(zhì)濃度、b：介質(zhì)長度濃度