第八章生化物質(zhì)的制備和分離純化

生化物質(zhì)的制備和分離純化分離純化的一般步驟選材細胞破碎抽提分離純化結(jié)晶純度鑒定保存8.1分離純化的一般步驟選材細胞破碎抽提分離（沉淀法、離子交換法）純化（分子篩、電泳）結(jié)晶純度鑒定保存第一步是前處理(pretreatment)。分離提純某一蛋白質(zhì)，首先要求把蛋白質(zhì)從原來的組織或細胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來，并保持原來的天然狀態(tài)，不丟失生物活性。第二步是粗分級(roughfractionation)。當?shù)鞍踪|(zhì)混合物提取液獲得后，選用一套適當方法，將所要的蛋白質(zhì)與其他雜蛋白質(zhì)分離開來。一般這一步的分級用鹽析、等電點沉淀和有機溶劑分級分離等方法。第三步是細分級(finefractionation)，也就是樣品的進一步提純。樣品經(jīng)粗分級以后，一般體積較小，雜蛋白大部分已被除去。進一步提純，一般使用層析法包括凝膠過濾，離子交換層析，吸附層析以及親和層析等。必要時還可選擇電泳法。8.2材料的選擇與處理含量高容易得到干擾物質(zhì)少價格便宜容易分離安全性好清理除雜冷凍干燥濃縮微生物、植物和動物都可做為制備蛋白質(zhì)的原材料，所選用的材料主要依據(jù)實驗目的來確定。對于微生物，應注意它的生長期，在微生物的對數(shù)生長期，酶和核酸的含量較高，可以獲得高產(chǎn)量，以微生物為材料時有兩種情況:（1）得用微生物菌體分泌到培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物和胞外酶等；（2）利用菌體含有的生化物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、核酸和胞內(nèi)酶等。植物材料必須經(jīng)過去殼，脫脂并注意植物品種和生長發(fā)育狀況不同，其中所含生物大分子的量變化很大，另外與季節(jié)性關(guān)系密切。對動物組織，必須選擇有效成份含量豐富的臟器組織為原材料，先進行絞碎、脫脂等處理。另外，對預處理好的材料，若不立即進行實驗，應冷凍保存，對于易分解的生物大分子應選用新鮮材料制備。（1）碾磨法/組織搗碎法是最普通和常見的細胞破碎方法。既可以使用普通的高速組織搗碎機、細胞勻漿器，也可使用專門的用于微生物細胞破碎的細菌磨等。

(2)超聲波破碎法使用專一的超聲波破碎儀，利用儀器所產(chǎn)生的超聲波（10~15kHz）機械震動后對組織細胞產(chǎn)生的空化作用（Cavitation）使細胞破碎。對動物材料的效果比微生物材料和植物材料要好。

(3)滲透壓法（高滲或低滲處理）滲透壓就是用來抗衡滲透傾向所需的一種力。

先將細胞置于高滲溶液(如蔗糖溶液)中平衡一段時間后，突然將其轉(zhuǎn)入到低滲緩沖液和水溶液中，則細胞壁會因滲透壓的突然變化而破碎。此法只適于處理細胞壁比較脆弱的細胞。

(5)表面活性劑處理法：在適當?shù)臏囟?、pH及低離子強度下，表面活性劑（如SDS、Tween、TritonX）能與脂蛋白形成微泡，使膜的滲透性改變或使之溶解。此法對膜結(jié)合的酶的提取是相當有效的，但對其他蛋白質(zhì)則易使之變性，甚至切斷肽鏈。

（6）細胞自溶法利用細胞自身的酶(8)酶處理方法用外源的溶菌酶或細胞壁分解酶(如蛋白酶、脂肪酶、核酸酶等)在一定條件下作用于細胞而使細胞壁破碎。但這種方法因需外加酶制劑，因此可能會對后續(xù)目的酶的提取產(chǎn)生不利的影響。8.4抽提物質(zhì)的抽提常常和細胞破碎步驟協(xié)同進行根據(jù)被提取物質(zhì)的溶解特性，選擇適當?shù)娜軇┦冀K保持低溫操作，防止生物活性物質(zhì)變性提取的原則是“少量多次”盡量去除干擾物質(zhì)防止水解酶的作用加入一定的保護試劑其他影響因素：pH、溶劑極性與離子強度等蛋白質(zhì)（包括酶）的提取大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機溶劑中，因些，可采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質(zhì)及酶。提取的溫度要視有效成份性質(zhì)而定。一方面，多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利于溶解，縮短提取時間。但另一方面，溫度升高會使蛋白質(zhì)變性失活，因此，基于這一點考慮提取蛋白質(zhì)和酶時一般采用低溫（5度以下）操作。為了避免蛋白質(zhì)提以過程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸，碘乙酸等）。

下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇。提取緩沖溶液的選擇必須有合適的pH和離子強度添加一些穩(wěn)定劑。如巰基乙醇、DTT、甘油、蔗糖、乙二醇等添加金屬離子或絡(luò)合劑。如Mg++、EDTA等添加蛋白酶抑制劑。如DPF（磷酸二異丙基氟）（二）有機溶劑提取法一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶，不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑，它們具的一定的親水性，還有較強的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。丁醇提取法對提取一些與脂質(zhì)結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)和酶特別優(yōu)越，一是因為丁醇親脂性強，特別是溶解磷脂的能力強；二是丁醇兼具親水性，在溶解度范圍內(nèi)（度為10%，40度為6.6%）不會引起酶的變性失活。另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣，也適用于動植物及微生物材料。8.5初級分離技術(shù)主要是根據(jù)不同物質(zhì)在各種物理化學性質(zhì)上的差別和對所分離純化物質(zhì)的要求而采取相應的分離純化方法根據(jù)溶解度不同的分離方法等電點沉淀法、鹽析法、有機溶劑沉淀法、PEG沉淀法根據(jù)分子大小不同的分離方法透析/超過濾、分子篩、離心法根據(jù)分子帶電性不同的分離方法離子交換層析、電泳法根據(jù)分子吸附性不同的分離方法吸附層析、親和層析沉淀技術(shù)透析/濃縮技術(shù)離心技術(shù)層析技術(shù)電泳技術(shù)8.5.1沉淀分離方法（PRICIPITATION）Dextran(右旋糖苷)polyvinylpyrrolidine(乙烯聚合物)acetone(丙酮)polyethyleneimine(聚乙烯亞氨)protamine(魚精蛋白)streptomycin(鏈霉素)等電點沉淀法鹽析法有機溶劑沉淀法PEG沉淀法其他（1）等電點沉淀法

（Isoelectricpointprecipitation）

粗分離技術(shù)沉淀后的蛋白質(zhì)不變性沉淀可能不完全加酸/堿時一定要攪拌緩慢，防止局部過酸/堿可用于去處雜蛋白或核酸等電沉淀法經(jīng)常與鹽析法或有機溶劑沉淀法聯(lián)合使用。單獨使用等電點法主要是用于去除等電點相距較大的雜蛋白。（2）鹽析法鹽溶鹽析原理：lgS=-Ks*II=∑CZ2/2：主要取決于蛋白質(zhì)的性質(zhì)和溶液的溫度與pHKs：主要取決于鹽的性質(zhì)。Ks越大，鹽析效果越好影響因素蛋白質(zhì)本身的因素：即不同的蛋白質(zhì)其發(fā)生鹽析的條件也不同如血漿蛋白質(zhì)的鹽析（Ks分段鹽析）蛋白質(zhì)鹽析時硫酸銨的飽和度纖維蛋白原20%優(yōu)球蛋白33%擬球蛋白40%清蛋白62%影響因素中性鹽的種類與離子強度lgS=-Ks*I；I=1/2∑CZ2硫酸銨氯化鈉硫酸銨濃度（飽和度）的計算與調(diào)整蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。其中應用最多的硫酸銨.它的優(yōu)點是溫度系數(shù)小而溶解度大（25度時飽和溶液為4.1M，即767克/升；0度時飽和溶解度為3.9M，即676克/升），在這一溶解度范圍內(nèi)，許多蛋白質(zhì)和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質(zhì)變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間，當用其他pH值進行鹽析時，需用硫酸或氨水調(diào)節(jié)。影響因素溫度:除對溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質(zhì)溶介度降低。但有的蛋白質(zhì)（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時溶解度低，更容易鹽析。影響因素PH:大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。在一定的PH和溫度條件下，改變離子強度的鹽析叫Ks分段鹽析在一定的鹽和離子強度條件下，改變PH和溫度的鹽析叫分段鹽析影響因素蛋白質(zhì)的濃度小比大好，但一般以2.5~3%為宜。蛋白質(zhì)濃度高時，欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)地一起沉淀出來（共沉現(xiàn)象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質(zhì)含量在2.5-3.0%。實際操作時的注意事項硫酸銨的純度要高通過小試或資料確定硫酸銨的飽和度確定硫酸銨的添加方式和添加量加鹽的速度要適中在硫酸銨飽和度較高時才發(fā)生鹽析的蛋白質(zhì)沉淀需離心鹽析常常和等電點沉淀協(xié)同進行鹽析可以在常溫下進行鹽析沉淀的蛋白質(zhì)含有較高的鹽蛋白質(zhì)在用鹽析沉淀分離后，需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去。常用的辦法是透析，即把蛋白質(zhì)溶液裝入秀析袋內(nèi)（常用的是玻璃紙），用緩沖液進行透析，并不斷的更換緩沖液，因透析所需時間較長，所以最好在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短。（3）有機溶劑沉淀法（冷乙醇、冷丙酮）原理：破壞蛋白質(zhì)的水化層并降低溶液的介電常數(shù)低溫操作添加0.05mol/L的中性鹽可以減少有機溶劑引起的蛋白質(zhì)變性，并可以提高蛋白質(zhì)的分離效果在酶的分離純化中，使用該方法時，應注意以下幾點。（1）由于有機溶劑易使酶發(fā)生變性，因此使用該方法時應該在低溫下進行。酶沉淀分離后，也應立即用水或緩沖液溶解，以降低有機溶劑濃度，避免變性。（2）有機溶劑沉淀法析出的酶沉淀一般比鹽析法析出的沉淀容易過濾或離心分離，分辨力比鹽析法好，溶劑也容易除去，但有機溶劑沉淀法易使酶變性，所以操作必須在低溫條件下進行。（3）添加0.05mol/L的中性鹽可以減少有機溶劑引起的酶變性，并可以提高酶的分離效果。但由于中性鹽會增加酶在有機溶劑中的溶解度，故中性鹽不宜添加太多。（4）有機溶劑沉淀法一般與等電點沉淀法聯(lián)合使用。即操作時溶液的pH值應控制在欲分離酶的等電點附近。（4）PEG沉淀法PEG：聚乙二醇（polyethyleneglycol），是一種具有螺旋狀和強親水性的大分子物質(zhì)，在生化分離中常用的是PEG2000-6000基本原理：利用空間排阻效應lgS+f=x–ac影響因素蛋白質(zhì)的大?。旱鞍踪|(zhì)的分子量越大其被沉淀下來所需要的PEG濃度越低蛋白質(zhì)的濃度：濃度高，易于沉淀，但分離效果差，因此以小于10mg/ml為好PEG的聚合度：PEG的聚合度越高，沉淀蛋白質(zhì)時所需要的濃度越低，但分離效果差，一般用常用的是PEG2000-6000其他影響因素溫度：PEG對酶（蛋白質(zhì)）有保護作用，因此可以在常溫操作，且一次可處理大量樣品PH：越接近PI，越易沉淀，一般在PH5-8的范圍內(nèi)影響不大離子強度：離子強度在小于2時影響不大（5）其他沉淀技術(shù)重金屬鹽沉淀（Hg++，Cu++，Zn++，F(xiàn)e+++，etal）生物堿試劑沉淀（單寧酸、苦味酸、鉬酸、三氯乙酸等）8.5.2離心技術(shù)（Centrifugation）

離心機的種類與用途離心分離方法的選擇離心條件的確定注意事項離心原理

將樣品放入離心機轉(zhuǎn)頭的離心管內(nèi)，離心機驅(qū)動時，樣品液就隨離心管做勻速圓周運動，于是就產(chǎn)生了一個向外的離心力。由于不同顆粒的質(zhì)量、密度、大小及形狀等彼此各不相同，在同一固定大小的離心場中沉降速度也就不相同，由此便可以得到相互間的分離。離心力和相對離心力

溶液中的固相顆粒做圓周運動時產(chǎn)生一個向外離心力，其定義為：

F=mω2r

式中：

F為離心力的強度；m為沉降顆粒的有效質(zhì)量；

ω為離心轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)動的角速度，其單位為r/min；

r為離心半徑(cm)，即轉(zhuǎn)子中心軸到沉降顆粒之間的距離。

很顯然，離心力隨著轉(zhuǎn)速和顆粒質(zhì)量的提高而加大，而隨著離心半徑的減小而降低。目前離心力通常以相對離心力Fcf表示，即離心力F的大小相對于地球引力(G)的多少倍，單位為g，其計算公式如下：

Fcf=1.119×10-5ω2r×g

可以看出，在同一轉(zhuǎn)速下，由于f的不同，F(xiàn)cf相差會很大，實際應用時一般取平均值。在離心實驗的報告中，F(xiàn)cf、r平均、離心時間t和液相介質(zhì)等條件都應表示出來，因為它們都與樣品的沉降速度有直接的聯(lián)系。顯然Fcf是一個只與離心機相關(guān)的參數(shù)，而與樣品并無直接的關(guān)系。

沉降速度與沉降系數(shù)

一個顆粒要沉降，它必須置換出位于它下方等體積的溶液，這只有當顆粒的質(zhì)量大于被置換出的液體的質(zhì)量時才能通過離心的手段達到，否則，在離心過程中顆粒將發(fā)生向上漂浮，而不是下沉。當顆粒在運動時，不論方向如何，它都要穿過溶劑分子，所產(chǎn)生的摩擦力總是與顆粒運動的方向相反。摩擦力的大小與顆粒的運動速度成正比，并且受顆粒的大小、形狀及介質(zhì)性質(zhì)的影響：

式中：

f為顆粒在濟劑中的摩擦系數(shù)．與顆粒的大小、形狀及介質(zhì)性質(zhì)相關(guān)；

v為顆粒的沉降速度。由于離心力的存在，顆粒將加速運動直到摩擦力與離心力相等。在這種情況下，顆粒所受到的凈作用力為零，顆粒將以最大速度運動。

式中Mp和Ms分別為顆粒的質(zhì)量及等體積的溶劑的質(zhì)量。

上式中的Mp和Ms很難確定，為了建立分子大小與沉降系數(shù)之間的關(guān)系，引入了沉降系數(shù)這一新的概念。沉降系數(shù)定義為沉降速度與離心力的比率或單位離心場中顆粒的沉降速度，它以svedberg單位計算，1S＝1×10-13s。例如，核糖核酸酶A的沉降系數(shù)為1．85×10-13s，即可記作1．85S。在生物化學、分子生物學及生物工程等書刊文獻中，對于某些大分子化合物，當它們的詳細結(jié)構(gòu)和分子量不很清楚時，常常用沉降系數(shù)這個概念去描述它們的大小。如核糖體RNA(rRNA)有30s亞基和50s亞基，這里的s就是沉降系數(shù)，現(xiàn)在更多地用于生物大分子的分類，特別是核酸。離心機的種類與用途普通離心機最大轉(zhuǎn)速:＜8000rpm；相對離心力RCF：＜1*104g高速離心機最大轉(zhuǎn)速:＜2.5*104rpm；相對離心力RCF：＜1*105g冷凍裝置、制動系統(tǒng)等超速離心機最大轉(zhuǎn)速:2.5*104rpm~1*105rpm；相對離心力RCF：1~5*105g冷凍裝置、離心管帽、真空系統(tǒng)、制動系統(tǒng)等制備型離心機、分析型離心機離心分離方法的選擇常規(guī)離心法差速離心技術(shù)密度梯度離心法：蔗糖密度梯度離心氯化銫密度梯度離心測定蛋白質(zhì)等的純度和分子量M=RTS/D（1-）S：沉降系數(shù)：單位離心力下粒子的沉降速率離心條件的確定離心力、離心速度、相對離心力離心時間溫度與PH

注意事項正確選擇離心條件注意平衡正確取樣8.5.3透析（Dialysis）

/超過濾（Ultra-filtration）

透析（Dialysis）與超過濾（Ultrafiltration）技術(shù)是利用具有特定大小均勻孔徑的透析膜或超濾膜的篩分機理，在不加壓（透析）或加壓（超過濾）的條件下，把酶提取液通過一層只允許水和小分子物質(zhì)選擇性透過的透析膜或超濾膜，而酶等大分子的物質(zhì)則被截流，從而達到把小分子物質(zhì)從酶提取液中除去（透析與超過濾）或同時達到濃縮酶液的目的（超過濾）。這也是透析與超過濾技術(shù)的最大區(qū)別之一。另外超過濾技術(shù)需要具有加壓系統(tǒng)的超濾儀，而透析技術(shù)則不需要專一的儀器。透析袋酶溶液蒸餾水加壓酶溶液超濾膜支持柵板超濾液透析裝置超濾裝置半透膜的材料：玻璃紙、再生纖維素、聚酰胺、聚砜等半透膜的物理特性：截留分子量Diaflo超濾膜截留分子量XM-300300000XM-100100000PM-2020000不同型號的半透膜其物理特性特別是截留分子量不同，因此在使用前應該根據(jù)實際的實驗要求做出恰當?shù)倪x擇。透析袋在制造時常會混入許多化學藥品，所以使用前最好在EDTA-NaHCO3，溶液中煮過，然后就泡在該溶液內(nèi)備用。超濾法超濾法是使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質(zhì)分子進行選擇