基因克隆的一般流程基因的獲得PCRRT-PCR載體準備感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化重組子篩選下游工作載體的選擇基因工程載體一般要求：能在宿主細胞中復(fù)制繁殖，有較高的自主復(fù)制能力。易進入宿主細胞，進入效率越高越好。合適的多克隆位點（MCS）可接受外源片段，且不影響其進入宿主細胞和在細胞中的復(fù)制。易從宿主細胞中分離純化出來，便于重組操作。有篩選標志，當其進入宿主細胞、或攜帶著外源序列進入宿主細胞都能容易被辨認和分離出來。便于克隆操作。常用的載體有質(zhì)粒、噬菌體和病毒等重組DNA技術(shù)的一般流程目的DNA的獲得目的DNA與載體的連接重組子導(dǎo)入受體細胞重組子的篩選和鑒定NGF基因的克隆(T-A克隆)NGF-sense:a

GAGCTC

aagatgctgtgcctcaagccagtNGF-antisense:at

GGGCCCgtctagatccagagtgtctg56pEGFP

熒光質(zhì)粒表達載體質(zhì)粒DNA的酶切反應(yīng)結(jié)果質(zhì)粒M酶切反應(yīng)M酶切反應(yīng)pEGFPpT-NGF酶切產(chǎn)物凝膠回收操作步驟

（GelExtractionKit）仔細切下含DNA的凝膠，置一稱重的1.5ml離心管中。稱重。按300lS1溶液/100mg凝膠加入的比例加入S1溶液，置50℃水浴10分鐘，使凝膠完全溶化，每2分鐘顛倒混勻一次。將溶化后的凝膠溶液移入吸附柱，置收集管中，9000g×30秒，倒掉收集管中的液體，再將吸附柱放入同一收集管中。在吸附柱中加入500lW1溶液，9000g×15秒，倒掉收集管中的液體，再將吸附柱放入同一收集管中。重復(fù)一次洗柱。將吸附柱放入同一收集管中。9000g×1分鐘。將吸附柱放入一新1.5ml離心管中，在吸附膜中央加入30lddH2O，靜置1分鐘，9000g×1分鐘。備用。重組子的篩選耐藥性基因外源質(zhì)粒賦予宿主抗生素抗性藍白斑篩選（互補現(xiàn)象）

lacZ＋plasmid和M15△cellstrain

關(guān)于連接酶定義：ATP存在下，在3’OH和5’P之間形成磷酸二酯鍵。特性：連接粘端的效率遠高于平端。策略：首選不匹配粘端次選匹配粘端，載體脫磷平端連接，延長時間，提高酶量匹配粘端連接圖示

不匹配粘端連接圖示連接反應(yīng)的建立連接反應(yīng)的溫度：粘性末端，按A-T，G-C含量計算，±5℃。如PstI（CTGCA↓G，12℃），EcoRI（G↓AATTC，8℃）。平末端，如EcoRⅤ（GAT↓ATC），可在室溫進行，不超過30℃，酶的用量要比粘性末端加大10-100倍。DNA量：摩爾數(shù)之比載體:目的DNA＝1:(1~3)

載體摩爾數(shù)目標基因片段堿基數(shù)×載體重量目標DNA摩爾數(shù)目標基因片段重量×載體堿基數(shù)

重組子轉(zhuǎn)入受體細胞體外重組的DNA引入受體細胞感受態(tài):受體細胞處于易于接受外源DNA的狀態(tài)原理:（1）遺傳物質(zhì)的傳遞（2）受體菌的選擇與改造重組質(zhì)