離子通道的資料第1頁/共60頁第一章離子通道概述

大約3百萬年前，脂質(zhì)雙層膜形成，這種雙分子滲透屏障使活細(xì)胞與環(huán)境隔開：優(yōu)點(diǎn)是：保留細(xì)胞存活的成分缺點(diǎn)是：使離子化的底物不易觸及離子化的廢物不易排除第2頁/共60頁建立新的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制變得迫在眉睫：一種辦法是：在膜上建立孔道：大到足夠讓小分子代謝產(chǎn)物可以通過，但又要小到足以保留大分子物質(zhì)--G-菌的外壁和線粒體膜就是按這種設(shè)計(jì)構(gòu)建的。另一種辦法是：設(shè)計(jì)更精細(xì)、更多樣、更具有選擇性的裝置來完成不同的工作—大多數(shù)胞漿膜就是這樣設(shè)計(jì)的。第3頁/共60頁

Howdothesemembranetransportdeviceswork?1980年以前，我們對(duì)它們的認(rèn)識(shí)來源于生理物質(zhì)流向的檢測(cè)（根據(jù)分子選擇性、飽和濃度、結(jié)合分子數(shù)目等）：傳統(tǒng)的觀點(diǎn)將之分為：載體(Carrier)和孔道(Pore)載體：象渡船一樣載著結(jié)合于其立體特異性結(jié)合部位的小分子物質(zhì)在膜兩側(cè)往返轉(zhuǎn)運(yùn)?？椎溃菏仟M窄的、充滿水的隧道，對(duì)少數(shù)離子和適合其孔徑的小分子通透。第4頁/共60頁

隨著蛋白提純技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，載體的“渡船假說”被否決，因?yàn)橐呀?jīng)有許多提純或克隆出的載體裝置均是大分子蛋白質(zhì)—它們太大，不可能按照所需的速率滲透或旋轉(zhuǎn)；其氨基酸殘基呈線形折疊形成跨膜片段。載體新觀點(diǎn)：大分子相對(duì)固定于膜內(nèi)，微小的運(yùn)動(dòng)局限于蛋白質(zhì)內(nèi)，結(jié)合位點(diǎn)暴露于胞膜內(nèi)、外側(cè)。如K+-Na+泵、Ca2+泵、Na+-Ca2+

交換體等。

這種新推論還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。2000年制作成的第一個(gè)載體晶體結(jié)構(gòu)支持這種新觀點(diǎn)。第5頁/共60頁

與載體“渡船學(xué)說”的命運(yùn)相反，有關(guān)另一種轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制---水性孔道的觀點(diǎn)，則得到了很好的印證:1965-1980年間，有關(guān)可興奮膜研究與模型孔道間研究的互動(dòng)，極大地加快和加深了我們對(duì)這種轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的了解。80’s出現(xiàn)的具有劃時(shí)代意義的技術(shù)進(jìn)步--膜片鉗技術(shù)(Neher和Sakmann)導(dǎo)致一個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)：離子通過膜的速率大于106/S,這樣高的速率除了“孔道”能勝任外，不可能有其他機(jī)制。其后制作成的晶體結(jié)構(gòu)亦顯示通道蛋白中的確存在一個(gè)連續(xù)的、水性的、慣穿全程的孔道。第6頁/共60頁研究簡史1902伯恩斯坦：神經(jīng)細(xì)胞膜對(duì)鉀離子選擇通透性1939霍奇金與赫胥黎：用微電極插入槍烏賊巨神經(jīng)纖維中，直接測(cè)量到膜內(nèi)外電位差。1949霍奇金和卡茨：細(xì)胞膜動(dòng)作電位的發(fā)生是膜對(duì)鈉離子通透性快速而特異性地增加，稱為“鈉學(xué)說”。1952霍奇金和赫胥黎：用電壓鉗技術(shù)定量研究槍烏賊巨神經(jīng)軸突細(xì)胞膜的離子電流和電導(dǎo)，首次提出離子通道的概念。H-H模型認(rèn)為，細(xì)胞膜的K+通道受膜上4個(gè)帶電粒子的控制，當(dāng)4個(gè)粒子在膜電場作用下同時(shí)移到某一位置時(shí)，K+才能穿過膜第7頁/共60頁1955卡斯特羅和卡茨：研究神經(jīng)-肌肉接頭突觸傳遞過程，發(fā)現(xiàn)突觸后膜終板電位的發(fā)生是由于神經(jīng)遞質(zhì)Ach作用于終板膜上受體的結(jié)果——確認(rèn)受化學(xué)遞質(zhì)調(diào)控的通道。60年代，用各種生物材料對(duì)不同離子通透性的研究表明，各種離子在膜上各自有專一性的運(yùn)輸機(jī)構(gòu)，曾經(jīng)提出運(yùn)輸機(jī)構(gòu)是載體、洞孔和離子交換等模型。1973年和1974年，阿姆斯特朗等分別在神經(jīng)軸突上測(cè)量到與離子通道開放相關(guān)的膜內(nèi)電荷的運(yùn)動(dòng)，稱為門控電流，確認(rèn)離子通道的開放與膜中帶電成分運(yùn)動(dòng)的依從性。1976年Neher和Sakmann創(chuàng)立了離子單通道電流記錄技術(shù)，為深入研究通道的結(jié)構(gòu)和功能提供了有力的工具。

第8頁/共60頁80年代初，先后從細(xì)胞膜上分離和純化了一些運(yùn)輸離子的功能性蛋白質(zhì)，并在人工膜上成功地重建了通道功能，從而肯定了離子通道實(shí)體就是膜上一些特殊蛋白質(zhì)分子或其復(fù)合物。應(yīng)用基因重組技術(shù)研究離子通道的結(jié)構(gòu)，1982和1984年，紐莫及合作者先后測(cè)定了N型Ach受體和Na+通道蛋白的氨基酸序列。第9頁/共60頁離子通道（ionchannels)是一類跨膜糖蛋白，它們?cè)诩?xì)胞膜上形成的親水性孔道使帶電荷的離子得以進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，是神經(jīng)、肌肉、腺體等許多組織細(xì)胞膜上的基本興奮單元，它們能產(chǎn)生和傳導(dǎo)電信號(hào)，具有重要的生理功能。第10頁/共60頁第11頁/共60頁第12頁/共60頁二、通道和離子為興奮所必需：

生理學(xué)家很早就知道離子在興奮性中扮演關(guān)鍵性角色。1881-1887，SidneyRinger發(fā)現(xiàn)灌流蛙心的溶液必須含有Na+、K+、Ca2+，并以一定的比例混合才能維持蛙心較長時(shí)間的跳動(dòng)。1888，WaltherNernst關(guān)于電位起源于溶液中電解質(zhì)滲透的觀點(diǎn)引發(fā)出很多有關(guān)生物電離子源的假說，如H+假說。1902，1912，JuliusBernstein正確地提出了以下假說：可興奮細(xì)胞的細(xì)胞膜靜息狀態(tài)下只選擇性地對(duì)K+通透，興奮時(shí)，膜對(duì)其它離子通透性增加。

---此即現(xiàn)代“膜假說”的基礎(chǔ)。第13頁/共60頁在20世紀(jì)里,與膜興奮有關(guān)的主要無機(jī)離子:

Na+、K+、Ca2+、H+、Mg2+、Cl-、HCO3-、HPO42-等作用都獲得了較深入的研究。神經(jīng)肌肉的興奮和電信號(hào)通過離子在通道中的運(yùn)動(dòng)來介導(dǎo)。其中Na+、K+、Ca2+、Cl-介導(dǎo)了絕大部分興奮反應(yīng)。第14頁/共60頁通道（Channel)的反應(yīng)，表現(xiàn)為通道孔的

開放(opening)和關(guān)閉(closing),

即：門控（gating）。開放的通道具有選擇性通透性，這一特性使通道開放時(shí)，只允許某些特定的離子順電化學(xué)差流動(dòng)；這種被動(dòng)擴(kuò)散有兩個(gè)特點(diǎn)：速率很高：>106/S不耗能由此區(qū)別于其他轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制.第15頁/共60頁第16頁/共60頁細(xì)胞膜等效電路第17頁/共60頁離子通道的開放與關(guān)閉第18頁/共60頁四、兩個(gè)重要的方程：Ohm’slaw：

I=gEorE=IRNernstequation：

R：氣體常數(shù)，T：絕對(duì)溫度，F(xiàn)：法拉第常數(shù)第19頁/共60頁第20頁/共60頁三、離子通道命名:

早期（50’s）的離子通道主要是根據(jù)膜的通透性（通道動(dòng)力學(xué)、藥理學(xué)、離子置換等確定）來命名。如Hodgkin和Huxley在巨大烏賊軸突上發(fā)現(xiàn)的Na+、K+電流和其后相應(yīng)命名的Na+、K+通道。80’s以后隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，大量的單通道被克隆出，其相應(yīng)的基因亦被找到，使通道的種類和數(shù)量成倍或幾十倍的增加，如Na+、K+、Ca2+通道就多達(dá)100多種。原有的通道命名辦法顯然不能適應(yīng)新的發(fā)展.第21頁/共60頁此外，根據(jù)通透性命名無法解決下列問題：不知道是哪種離子如何命名？不知道哪種是主要離子如何命名？如果多種通道用同一種離子如何命名？通道命名五花八門：

如軟體動(dòng)物神經(jīng)節(jié)通道A,B,C(Adam1980)

心肌浦氏纖維qr,si,x1通道(McAllister1975)

根據(jù)抑制劑命名:氨氯吡脒敏感的Na+通道根據(jù)遞質(zhì):甘氨酸通道根據(jù)突變:Shaker通道根據(jù)疾病:CFTR(膀胱纖維化跨膜調(diào)節(jié)物)

根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的順序:GIRK第22頁/共60頁系統(tǒng)命名：近年已開始進(jìn)行以通道結(jié)構(gòu)序列與進(jìn)化的關(guān)系為基礎(chǔ)的系統(tǒng)命名。最先在哺乳動(dòng)物電壓依賴性鉀通道作此嘗試：Kv1.1,Kv1.2…….8.1(Chandy1991),國際藥理學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUPHAR)正在按此方法對(duì)其他通道進(jìn)行系統(tǒng)命名,有的已被公布,如鈣通道和鈉通道系列.通道家族：不同通道系列之間也有很多相似的功能特征,如電壓門控的Na+、K+、Ca2+通道之間,乙酰膽堿、甘氨酸和GABA通道之間都有很多相似之處，根據(jù)通道的進(jìn)化同源性，可將它們分成不同的超級(jí)家族和家族。第23頁/共60頁五、離子通道的特性：（1）選擇性：離子通道最重要、最顯著的特征之一就是其離子選擇性。選擇性又取決于：

通道最小直徑和離子直徑的相對(duì)大小。通道親水性孔道的帶電基團(tuán)和電荷的性質(zhì)。異電相吸的原則。對(duì)帶同種電荷的通道又有兩種情況：含弱極性位點(diǎn)的通道：選擇性與離子脫水性有關(guān)（大離子易脫水，反易通過）含強(qiáng)極性位點(diǎn)的通道：小離子更易接近位點(diǎn)第24頁/共60頁（2）門控特性：離子通道在多數(shù)時(shí)間是關(guān)閉的，只有被激活時(shí)才開放。依據(jù)其調(diào)控機(jī)制，可分為：配體門控性離子通道（ligand-gatedionchannel）電壓門控性離子通道（voltage-gatedionchannel）離子通道開關(guān)要經(jīng)過三種以上狀態(tài)轉(zhuǎn)換：第25頁/共60頁第26頁/共60頁膜片鉗技術(shù)用特制的玻璃電極吸附于細(xì)胞表面，使之形成10～100GΩ的密封(giga-seal)，被孤立的小膜片面積為μm2量級(jí)，內(nèi)中僅有少數(shù)離子通道。對(duì)該膜片實(shí)行電壓鉗位，可測(cè)量單個(gè)離子通道開放產(chǎn)生的pA（10-12安培）級(jí)電流，這種通道開放是一種隨機(jī)過程。通過觀測(cè)單個(gè)通道開放和關(guān)閉的電流變化，可直接得到各種離子通道開放的電流幅值分布、開放幾率、開放壽命分布等功能參量，并分析它們與膜電位、離子濃度等之間的關(guān)系。第27頁/共60頁膜片鉗技術(shù)(Patch-clampTechniques)一、儀器設(shè)備：倒置顯微鏡、微操縱器、給藥系統(tǒng)、防震工作臺(tái)等第28頁/共60頁膜片鉗放大器、數(shù)據(jù)采集裝置、計(jì)算機(jī)、采集分析軟件等第29頁/共60頁電極拉制儀，拋光儀等第30頁/共60頁第31頁/共60頁第32頁/共60頁第33頁/共60頁Voltage-gatedchannel第34頁/共60頁Ligand-gatedchannel第35頁/共60頁將電極吸附的膜片從細(xì)胞膜上分離出來，以膜的外側(cè)向外或膜的內(nèi)側(cè)向外等方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。對(duì)小細(xì)胞的電壓鉗位、改變膜內(nèi)外溶液成分以及施加藥物都很方便。第36頁/共60頁第37頁/共60頁膜片鉗技術(shù)為從分子水平了解生物膜離子通道的開啟和關(guān)閉、動(dòng)力學(xué)選擇性和通透性等膜信息提供了直接手段為了解膜內(nèi)第二信使的作用及過程，神經(jīng)遞質(zhì)和激素的分泌過程與作用，深入闡明藥物與化學(xué)物的作用機(jī)理等提供了極為有用的研究手段。可用于單細(xì)胞上觀測(cè)單一通道電流,如心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。在心血管領(lǐng)域，應(yīng)用膜片鉗技術(shù)可以在分子和亞分子水平上深入了解正常心律的形成和維持、各種心律失常發(fā)生發(fā)展的機(jī)制及藥物預(yù)防治療的基礎(chǔ)，極大推動(dòng)著基礎(chǔ)電生理和電藥理的研究應(yīng)用。第38頁/共60頁

離子通道是細(xì)胞膜上的大分子蛋白質(zhì)孔道.

離子通道是可興奮細(xì)胞的可興奮成分.

離子通道介導(dǎo)神經(jīng)、肌肉和突觸的電信號(hào)離子通道通過開放、關(guān)閉和協(xié)同作用來編碼神經(jīng)系統(tǒng)的信號(hào)和反應(yīng)。第39頁/共60頁第40頁/共60頁第二章鈉離子通道一、鈉通道概述

Na+通道廣泛存在于可興奮細(xì)胞膜上，是絕大多數(shù)可興奮細(xì)胞動(dòng)作電位上升相的主要電流成分。第41頁/共60頁第42頁/共60頁第43頁/共60頁二、鈉通道的分子結(jié)構(gòu)第一個(gè)離子通道基因克隆是從電鰻鈉通道基因中獲得的。從其他動(dòng)物克隆出的鈉通道均具備電鰻鈉通道基本結(jié)構(gòu)。鈉通道是一個(gè)寡聚體，約由2000個(gè)氨基酸殘基組成。含α亞單位（260KD）、β1亞單位（36-38KD）β2亞單位（33KD）。第44頁/共60頁第45頁/共60頁第46頁/共60頁Na+通道α亞單位、通道的激活與失活第47頁/共60頁亞單位（subunit）：α亞單位有4個(gè)同源結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域含300-400個(gè)氨基酸殘基，組成6個(gè)跨膜區(qū)（S1-S6），區(qū)內(nèi)氨基酸形成α螺旋。S4是電壓敏感區(qū)，富含精氨酸或賴氨酸等帶正電荷的殘基，能感受膜電位的變化。在S5-S6之間還有一個(gè)發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)，是形成親水孔道且具有選擇性地讓離子通過的部分，稱之為孔道區(qū)（poreregion），是藥物和毒素作用的部位。C-端和N-端均在胞內(nèi)。第48頁/共60頁β1亞單位含213個(gè)氨基酸，形成一個(gè)α螺旋。C-端在胞內(nèi)，N-端在胞外。β1亞單位與通道的激活和失活過程有關(guān)。β2亞單位的功能尚不清楚。若只有α亞單位,通道表現(xiàn)為失活緩慢,

若與β1亞單位共同表達(dá),通道失活速率增加5倍，電流幅值增加2.5倍。第49頁/共60頁三、鈉通道的系統(tǒng)分類：如Nav1.4主要存在于骨骼肌;Nav1.5主要存在于心肌.第50頁/共60頁以前的分類和命名依α亞單位不同分為I、II、III、μ1、h1、NaG等多種亞型。第51頁/共60頁四、鈉通道電流的特性：(1)不同的組織Na+通道分布的情況有所不同，但Na+通道之間的電流特性的差別相對(duì)K+，Ca2+通道之間要小得多。根據(jù)對(duì)電壓依賴性和TTX的敏感性不同，Na+通道又可分成：INa：電壓門控性Na+通道（TTX－敏感的Na+通道、快Na+通道）：AP的去極相INa,B或INa,S：非電壓門控性Na+通道（TTX-不敏感的Na+通道、慢Na+通道、背景Na+電流）：竇房結(jié)，4相晚期有助于起搏電流（If）的形成第52頁/共60頁(2)INa電流的特點(diǎn)：當(dāng)膜電位鉗制在－70mv左右時(shí)，INa為內(nèi)向電流，呈電壓依賴性，通道開放的閾電位為-60～-50mv,

激活和失活都比較快τact=0.1～0.4ms,τi