藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)

及過(guò)程控制中國(guó)藥品生物制品檢定所馬仕洪年5月26日上海website:e-mail:mash@tel/p>

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1藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第1頁(yè)藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過(guò)程控制藥品原因環(huán)境影響培養(yǎng)觀察抽樣檢驗(yàn)破壞試驗(yàn)方法驗(yàn)證過(guò)程控制2中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第2頁(yè)無(wú)菌/微生物程度檢驗(yàn)理念環(huán)境確保培養(yǎng)基確保無(wú)菌性檢驗(yàn)靈敏度檢驗(yàn)有效方法方法驗(yàn)證SOP操作有效結(jié)果可靠結(jié)論結(jié)果判斷3中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第3頁(yè)微生物檢驗(yàn)過(guò)程控制一、試驗(yàn)設(shè)施（硬件——物質(zhì)保障）二、檢驗(yàn)程序（軟件——有效結(jié)果）三、結(jié)果判斷（調(diào)查——可靠結(jié)論）4中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第4頁(yè)一、試驗(yàn)設(shè)施試驗(yàn)室系統(tǒng)操作環(huán)境關(guān)鍵設(shè)備對(duì)照培養(yǎng)基物質(zhì)保障5中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第5頁(yè)（一）、試驗(yàn)室系統(tǒng)潔凈試驗(yàn)條件有效性：整體10000級(jí)、局部100級(jí)。安全性：保護(hù)樣品、人員和環(huán)境?？刹僮餍裕悍奖恪⒖旖?、順暢。潔凈試驗(yàn)條件維護(hù)、驗(yàn)證陽(yáng)性菌試驗(yàn)室到達(dá)P2生物安全標(biāo)準(zhǔn)6中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第6頁(yè)試驗(yàn)室改造示例：原布局圖

確定布局圖

提議布局圖1

提議布局圖2

試驗(yàn)室系統(tǒng)——中檢所微生物試驗(yàn)室7中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第7頁(yè)（一）、試驗(yàn)室系統(tǒng)試驗(yàn)室系統(tǒng)管理與維護(hù)：1、屏障系統(tǒng)有效性壓差、風(fēng)速、微粒、照度（外包服務(wù)協(xié)議）2、清潔、靜態(tài)與動(dòng)態(tài)監(jiān)控、熏蒸3、環(huán)境菌庫(kù)酒精棉球分離微生物新潔爾滅分離微生物8中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第8頁(yè)環(huán)境菌庫(kù)潔凈環(huán)境常見(jiàn)菌（浮游菌）：頭狀葡萄球菌（Staphylococcus

capitis）溶血葡萄球菌（Staphylococcus

haemolyticus）緩癥鏈球菌（Streptococcus

mitis）科氏葡萄球菌（Staphylococcus

cohnii）藤黃微球菌（Micrococcus

luteus）9中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第9頁(yè)（二）、操作環(huán)境1、隔離器2、生物安全柜3、超凈工作臺(tái)10中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第10頁(yè)（二）、操作環(huán)境分類樣品安全人員安全環(huán)境要求點(diǎn)評(píng)隔離器？驗(yàn)證困難，滅菌不徹底：假陽(yáng)性滅菌劑殘留：假陰性生物安全柜？動(dòng)態(tài)驗(yàn)證困難，不適合多任務(wù)檢驗(yàn)活動(dòng)超凈工作臺(tái)經(jīng)典、廉價(jià)、適合多任務(wù)檢驗(yàn)活動(dòng)。提升試驗(yàn)室新風(fēng)供給、加強(qiáng)試驗(yàn)室監(jiān)控能夠揚(yáng)長(zhǎng)避短11中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第11頁(yè)搽拭試驗(yàn)菌株菌液計(jì)數(shù)回收計(jì)數(shù)回收率大腸埃希菌191894.7%金黃色葡萄球菌646093.8%菌液稀釋、分液誤差為：5.5%表面搽拭操作回收率大于99%12中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第12頁(yè)（三）、關(guān)鍵設(shè)備微生物檢驗(yàn)薄膜過(guò)濾儀一次性薄膜過(guò)濾培養(yǎng)器應(yīng)急檢驗(yàn)用一次性薄膜過(guò)濾培養(yǎng)器13中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第13頁(yè)（四）、對(duì)照培養(yǎng)基培養(yǎng)基適用性（靈敏度）；培養(yǎng)基性能穩(wěn)定性（標(biāo)準(zhǔn)化）。對(duì)照培養(yǎng)基理化評(píng)價(jià)（可控性）生物學(xué)評(píng)價(jià)（有效性）回收率比較MPN比較生長(zhǎng)曲線比較生態(tài)評(píng)價(jià)一些CRS標(biāo)準(zhǔn)固態(tài)培養(yǎng)基液態(tài)培養(yǎng)基瓊脂加減法14中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第14頁(yè)二、檢驗(yàn)程序環(huán)境確保培養(yǎng)基確保無(wú)菌性檢驗(yàn)靈敏度檢驗(yàn)有效方法方法驗(yàn)證SOP操作有效結(jié)果可靠結(jié)論結(jié)果判斷15中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第15頁(yè)二、檢驗(yàn)程序接收任務(wù)試驗(yàn)方案試驗(yàn)準(zhǔn)備樣品查對(duì)試驗(yàn)操作過(guò)程監(jiān)控培養(yǎng)觀察有效結(jié)果物質(zhì)保障16中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第16頁(yè)試驗(yàn)室管理規(guī)范（軟件）中檢所抗生素室微生物試驗(yàn)室質(zhì)量管理體系編寫說(shuō)明及同意頁(yè)1試驗(yàn)室概況1.1試驗(yàn)室介紹1.2試驗(yàn)室通訊資料1.3試驗(yàn)室認(rèn)可項(xiàng)目/參數(shù)表1.4試驗(yàn)室平面圖及功效區(qū)域1.5儀器設(shè)備總覽1.6常備試劑耗材一覽表1.7試驗(yàn)室發(fā)展目標(biāo)2管理規(guī)范2.1安全管理2.2業(yè)務(wù)流程2.3人員管理（6個(gè)SOP）2.4樣品管理（3個(gè)SOP）3標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程3.1檢驗(yàn)工作SOP（13個(gè)）3.2儀器操作SOP（30個(gè)）3.3試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)SOP（9個(gè)）4試驗(yàn)室保障4.1試驗(yàn)室設(shè)施、設(shè)備及消耗品供給商確定標(biāo)準(zhǔn)4.2試驗(yàn)室設(shè)施服務(wù)商4.3試驗(yàn)設(shè)備供給商4.4試驗(yàn)室消耗品供給商17中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第17頁(yè)（一）、試驗(yàn)準(zhǔn)備試驗(yàn)準(zhǔn)備應(yīng)堅(jiān)持“平戰(zhàn)結(jié)合”，物質(zhì)準(zhǔn)備有備無(wú)患，應(yīng)隨時(shí)確?！皝?lái)之能戰(zhàn)”。尤其注意常備使用期要求物品：培養(yǎng)基、沖洗液、濾器、小型試驗(yàn)器材等。18中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第18頁(yè)試驗(yàn)準(zhǔn)備——無(wú)菌室專用酒精棉球制備

試驗(yàn)準(zhǔn)備——場(chǎng)地清潔

試驗(yàn)準(zhǔn)備——臺(tái)面清潔

19中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第19頁(yè)（二）、樣品查對(duì)盡快取得樣品，確保樣品傳遞過(guò)程中完整性、安全性、有效性；仔細(xì)查對(duì)樣品及樣品資料，高度關(guān)注媒體公布樣品（問(wèn)題樣品），同時(shí)盡可能獲取非問(wèn)題樣品及同類樣品，進(jìn)行比較試驗(yàn)、比較分析；樣品外觀檢驗(yàn)、完整性檢驗(yàn)。20中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第20頁(yè)樣品外觀檢驗(yàn)——欣弗

樣品外觀檢驗(yàn)——刺五加

樣品外觀檢驗(yàn)——雙黃連

樣品完整性真空檢漏

21中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第21頁(yè)（三）、試驗(yàn)操作不停完善標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程（SOP），嚴(yán)格防止試驗(yàn)室污染。試驗(yàn)人員培養(yǎng)基試驗(yàn)器材試驗(yàn)環(huán)境檢驗(yàn)結(jié)果待檢樣品原料輔料設(shè)備環(huán)境藥品（食品）人員藥品食品生產(chǎn)過(guò)程中可能污染微生物主要步驟藥品食品微生物檢驗(yàn)過(guò)程中可能污染微生物主要步驟22中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第22頁(yè)試驗(yàn)操作——物料進(jìn)場(chǎng)消毒液搽拭物品外表面潔凈傳遞（風(fēng)淋、紫外照射）雙層無(wú)菌包裝關(guān)鍵區(qū)外圍試驗(yàn)操作——人員進(jìn)場(chǎng)一更二更關(guān)鍵操作區(qū)試驗(yàn)操作——無(wú)菌操作技術(shù)23中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第23頁(yè)（四）、試驗(yàn)過(guò)程監(jiān)控樣品監(jiān)控手指監(jiān)控沉降菌監(jiān)控?zé)o菌檢驗(yàn)框架示意圖24中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第24頁(yè)三、結(jié)果判斷長(zhǎng)菌是否分離判定溯源調(diào)查結(jié)果匯報(bào)可靠結(jié)論有效結(jié)果物質(zhì)保障25中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第25頁(yè)三、結(jié)果判斷

是不是微生物？是什么微生物？微生物來(lái)自哪里？幾點(diǎn)思索

參見(jiàn)：《FTIR法用于藥品檢出菌與藥品微生物檢驗(yàn)潔凈室環(huán)境菌相同性考察》《藥學(xué)學(xué)報(bào)》，，42（11）：1189～1194《判斷無(wú)菌檢驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果有效性試驗(yàn)探討》《藥品分析雜志》，，28（05）：66～71

26中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第26頁(yè)1、長(zhǎng)菌是否？渾不渾濁?物理改變、化學(xué)改變還是生物改變？一靠經(jīng)驗(yàn)二靠試驗(yàn)三靠嚴(yán)格程序控制防止干擾27中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第27頁(yè)是不是微生物？（1）、液體培養(yǎng)基渾濁物理改變？化學(xué)改變？生物學(xué)改變？（2）、平板上菌落瓊脂表面、瓊脂中、瓊脂和平皿夾層

菌落or藥渣？28中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第28頁(yè)菌落or藥渣？經(jīng)60Coγ射線大劑量照射再檢驗(yàn)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間到7天重新劃線培養(yǎng)鏡檢29中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第29頁(yè)2、分離判定（1）馬上轉(zhuǎn)接2ml該培養(yǎng)物至相同培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；（2）取5支凍存管，每管分裝1ml渾濁培養(yǎng)物，-80℃保留；（3）取渾濁培養(yǎng)物在TSA平板/血瓊脂上劃線，分離污染微生物；（4）假如發(fā)覺(jué)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)管變渾濁，還應(yīng)增加血平板劃線，并在厭氧條件下培養(yǎng)分離厭氧菌。由平板分離到菌落應(yīng)深入判定，并逐一保藏。30中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第30頁(yè)是什么微生物？宏觀：生長(zhǎng)形態(tài)微觀：鏡檢判定：生化判定（API、BD）核酸判定（16sRNA、DNA）……31中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第31頁(yè)3、溯源調(diào)查樣品陽(yáng)性培養(yǎng)物分離菌株檢驗(yàn)過(guò)程監(jiān)控菌株環(huán)境菌（近期、遠(yuǎn)期）現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查搜集菌株判定與相同性分析相結(jié)合傳統(tǒng)方法與新技術(shù)相結(jié)合不一樣方法交叉驗(yàn)證32中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第32頁(yè)微生物來(lái)自哪里？

相同性分析同源性分析脈沖場(chǎng)電泳（PFGE）、傅立葉紅外（FTIR）

33中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第33頁(yè)SamplePreparationAutomatedmeasurementafterdryingofthesamples!2.Suspending1.Harvesting3.LoadingFT-IRSpektrumofmicroorganisms圖不一樣起源陰溝腸桿菌紅外圖譜聚類關(guān)系34中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第34頁(yè)TheInfraredSpectrumlipidsproteinscarbohydratessaltswatercellwallcapsulesDNA,RNAflagellates,piliribosomevacuoles...FT-IRspectrumisafingerprintofthecellsBiochemicalStructureofCells35中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第35頁(yè)36中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第36頁(yè)溯源性分析例1——欣弗事件

圖29欣弗培養(yǎng)物圖30欣弗培養(yǎng)物分離菌株鏡檢37中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第37頁(yè)編號(hào)濾筒中形態(tài)革蘭染色BD判定0206L渾濁，產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘質(zhì)沙雷菌（Serratiamarcescens）0206G渾濁，猛烈產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘質(zhì)沙雷菌（Serratiamarcescens）0112G致密片狀、絮狀物，振搖不散G+長(zhǎng)鏈桿菌（液體培養(yǎng)物直接涂片）0104L顆粒狀懸浮物，振搖能散G+長(zhǎng)鏈桿菌（液體培養(yǎng)物直接涂片）298L；298G渾濁，產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘質(zhì)沙雷菌（Serratiamarcescens）303L；303G渾濁，產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、陰溝腸桿菌（Enterobacter

cloacae）305L；305G渾濁，產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘質(zhì)沙雷菌（Serratiamarcescens）306L；306G渾濁，產(chǎn)氣G-球桿菌肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）307G渾濁，產(chǎn)氣G-球桿菌肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）308L渾濁（Alcaligenesfaecalis）308G致密片狀、絮狀物，振搖不散G+長(zhǎng)鏈桿菌（液體培養(yǎng)物直接涂片）309L渾濁（Alcaligenesfaecalis）309G致密片狀、絮狀物，振搖不散G+長(zhǎng)鏈桿菌（液體培養(yǎng)物直接涂片）304G渾濁G-桿菌嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonasmaltophilia）38中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第38頁(yè)溯源性分析例1——欣弗事件頭狀葡萄球菌頭狀亞種（Staphylococcus

capitissspcapitis）溶血葡萄球菌（Staphylococcus

haemolyticus）緩癥鏈球菌（Streptococcus

mitis）科氏葡萄球菌科氏亞種（Staphylococcus

cohniissp

cohnii）藤黃微球菌（Micrococcus

luteus）溶血葡萄球菌（Staphylococcus

haemolyticus）。監(jiān)測(cè)到環(huán)境菌株39中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第39頁(yè)溯源性分析例2編號(hào)BD判定走廊1B.pumilus走廊2M.luteus走廊3/無(wú)菌室4C.urealyticum無(wú)菌室5K.kristinae無(wú)菌室6C.urealyticumC1524-FS.capraeC1524-BS.capraeC1525-B1-1S.warneriC1525-B1-2S.epidermidisC1525-B2S.warneriC1525-F1S.warneriC1525-F2-1S.capitisC1525-F2-2S.epidermidisC1526-B1C.urealyticumC1526-B2S.warneriC1526-F1S.epidermidisC1526-F2S.haemolyticus菌株16sRNA判定可信度C1524-FS.haemolyticus99%C1524-BS.haemolyticus98%C1526-F2S.haemolyticus100%雙黃連注射液利巴韋林注射液FTIR相同性分析DuPontRiboPrinter基因指紋分析40中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第40頁(yè)幾點(diǎn)思索（1）、怎樣才算是同一株菌？

需要深入認(rèn)識(shí)微生物本身微生物變異與保守相對(duì)性；分析方法可變性與微生物本身可變性；生物學(xué)先鋒琳恩·馬古利斯(LynnMargulis)曾表示：“假如將一個(gè)特殊質(zhì)粒植入大腸桿菌，大腸桿菌便會(huì)突然間變成克雷伯氏桿菌”。41中國(guó)藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過(guò)程控制專家講座第41頁(yè)幾點(diǎn)思索（2）、什么是最適宜技術(shù)？

需要深入認(rèn)識(shí)分析微生物技術(shù)和伎倆形態(tài)學(xué)分析與相同性分析（生化反應(yīng)譜、片段相同性、FTI