稀釋涂布平板法注意：移液管需要經(jīng)過滅菌。操作時(shí)，試管口和移液管離火焰1~2cm處.涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？問題討論涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？應(yīng)從操作的各個(gè)細(xì)節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、

吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要

在酒精燈火焰周圍等等。問題討論微生物的恒溫培養(yǎng)微生物的恒溫培養(yǎng)微生物的恒溫培養(yǎng)菌種的保存臨時(shí)保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4℃冰箱保存。長期保存：甘油冷凍管藏法微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng).DAT四、實(shí)驗(yàn)操作成果評(píng)價(jià)（一）培養(yǎng)基的制作是否合格如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2

d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。（二）接種操作是否符合無菌要求如果培養(yǎng)基上（三）是否進(jìn)行了及時(shí)細(xì)致的觀察與記錄培養(yǎng)12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會(huì)有有明顯不同，及時(shí)觀察記錄的同學(xué)會(huì)發(fā)現(xiàn)這這一點(diǎn)，并能觀察到其他一些細(xì)微的變化。這一步的要求主要是培養(yǎng)學(xué)生良好的科學(xué)態(tài)度與習(xí)慣。兩個(gè)主要目的：從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌；統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌。在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微微生物生長，同時(shí)抑制或阻止其他種種類微生物生長的培養(yǎng)基。選擇培養(yǎng)基背景知識(shí)測定微生物數(shù)量的方法：測定微生物數(shù)量的方法：1．直接計(jì)數(shù)法：最常用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法。背景知識(shí)測定微生物數(shù)量的方法：1．直接計(jì)數(shù)法：最常用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法。先將待測樣品制成懸液，然后取一定量的懸液放在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來計(jì)算出單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)。背景知識(shí)優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡單、能觀察微生物的形態(tài)特征。優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡單、能觀察微生物的形態(tài)特征。缺點(diǎn)：難以計(jì)數(shù)微小量多的細(xì)菌。一般用于純培養(yǎng)懸浮液中各種單細(xì)胞菌體的計(jì)數(shù)。2．間接計(jì)數(shù)法：最常用稀釋平板計(jì)數(shù)法。（二）統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目（二）統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的理論依據(jù)：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長的一個(gè)菌落，來源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌。因此，恰當(dāng)?shù)南♂尪仁浅晒Φ亟y(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的關(guān)鍵。為為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，通常將幾個(gè)稀釋度下

的菌液都涂布在平板上，培養(yǎng)后再選擇菌落落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。每克樣品中的菌株數(shù)=(C÷V)×MC：某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)V：涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(ml)

M：稀釋倍數(shù)統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。這是因?yàn)楫?dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落。因因此結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)來來表示。注意：兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)。在對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計(jì)結(jié)果。第一位同學(xué)在該濃度下涂布了一個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)為230。第二位同學(xué)在該深度下涂布了三個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別為21、212和256，該同學(xué)以這三個(gè)平板菌落數(shù)的平均值163作為統(tǒng)計(jì)結(jié)果。實(shí)例1你認(rèn)為哪位同學(xué)的結(jié)果更接近真實(shí)值？這兩位同學(xué)的實(shí)驗(yàn)需要改進(jìn)嗎？如果需要，如何改進(jìn)？?你認(rèn)為哪位同學(xué)的結(jié)果更接近真實(shí)值？這兩位同學(xué)的實(shí)驗(yàn)需要改進(jìn)嗎？如果需要，如何改進(jìn)？第一位同學(xué)只涂布了一個(gè)平板，沒有設(shè)置重復(fù)組，因此結(jié)果不具有說服力。第二位同學(xué)考慮到設(shè)置重復(fù)組的問題，涂布了3個(gè)平板，但是，其中1個(gè)平板的計(jì)數(shù)結(jié)果與

另2個(gè)相差太遠(yuǎn)，說明在操作過程中可能出

現(xiàn)了錯(cuò)誤，因此，不能簡單地將3個(gè)平板的計(jì)計(jì)數(shù)值用來求平均值。?因此，這兩位同學(xué)的實(shí)驗(yàn)需要改進(jìn)，在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要涂布至少3個(gè)平板，作作為重復(fù)組，才能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說服力與準(zhǔn)確性。在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，一定要

考慮所設(shè)置的重復(fù)組的結(jié)果是否一致，結(jié)果不一致，意味著操作有誤，需要重新實(shí)驗(yàn)。說明設(shè)置重復(fù)組的重要性。在做本課題的實(shí)驗(yàn)時(shí)，A同學(xué)從對(duì)應(yīng)106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個(gè)菌落。但但是，其它同學(xué)在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個(gè)菌落。其他同學(xué)認(rèn)為A同學(xué)的結(jié)果有問題。他

們分析可能是A同學(xué)的培養(yǎng)基被雜菌污染了，或者培養(yǎng)基中混入了其他含氮物質(zhì)，因而導(dǎo)致不能分解尿素的細(xì)菌也能在該培養(yǎng)基上生長。實(shí)例2但是，A同學(xué)確信自己的實(shí)驗(yàn)操作準(zhǔn)確無誤，與其他同學(xué)的結(jié)果之所以不相同，是因因?yàn)樽约核x用的土壤樣品不同。但是，A同學(xué)在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的時(shí)候并沒有設(shè)置對(duì)照，因而此時(shí)也拿不出令同學(xué)們信服的證據(jù)。你能通過設(shè)置對(duì)照，幫助A同學(xué)排除上述兩個(gè)可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素嗎？一是由于土樣不同，二是由于培養(yǎng)基污染或操作失誤。究竟是哪個(gè)原因，可以通過實(shí)驗(yàn)來證明。一種方案：可以由其他同學(xué)用與A同學(xué)一

樣的土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如果結(jié)果與A同學(xué)一

致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問問題。另一種方案：將