真菌學(xué)實驗報告

實驗?zāi)康模?/p>

1.1了解真菌形態(tài)的基本特性。

1.2掌握絲狀真菌制片方法。

1.3掌握內(nèi)生真菌的分離方法

1.4掌握真菌的鑒定方法。

—.前言：

真菌廣泛分布于地球表面，從高山、湖泊到田野、森林，從

海洋、高空到赤道、兩極，到處都有真菌。真菌雖然不在空氣中生長

繁殖,但它的抱子卻成群的漂浮在天空，只要稍微注意你會發(fā)現(xiàn)人類

本來生活在真菌的汪洋大海中。

當(dāng)今世界，生物技術(shù)已邁入世界經(jīng)濟的支柱產(chǎn)業(yè)，真菌學(xué)在

生物技術(shù)的大潮中得到了長足的發(fā)展。真菌是原始的真核生物,具有

廣泛的多樣性,真菌生長我繁殖迅速，在很短的時間內(nèi)就可以得到比

動物和植物多得多的后代,可以直接、快速地進行遺傳性狀分離的分

析。因此，真菌可以作為研究基礎(chǔ)生物學(xué)過程中的一個重要工具，真

菌基因的多樣性以及真菌分子生物學(xué)的發(fā)展，為生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)提供了

一個廣闊的天地。

植物的生長環(huán)境直接影響內(nèi)生真菌的生物多樣性，植物物

種的年代越長遠(yuǎn),其生物內(nèi)生真菌的多樣性越豐富：抗病原性能越強

的植物,其所含的內(nèi)生真菌具有抗菌活性的也許行就越大；其所含的

內(nèi)生真菌有也許產(chǎn)生與植物相同或相似的抗菌無知或產(chǎn)生抗菌活性

物質(zhì)也許參與了藥用植物的抗菌過程，本實驗通過植物病原真菌和G

+、G—細(xì)菌的克制實驗發(fā)現(xiàn)莖，根，花，種子或果實內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)

物具有不同限度的抑菌能力，并且對G+、G-有普片遍的抑菌作用。

研究和開發(fā)內(nèi)生真菌的尋找新的抗菌活性物質(zhì)具有廣泛的應(yīng)用前景。

三.材料與方法：

3.1.1材料：

在校園內(nèi)采集銀杏、喜樹、桂花樹樣品涉及葉、莖、

根、花、種子或果實。

3.1.2.藥品與試劑：

葡萄糖、蛋白膝、KH2P04?3H20、MgS04?7H20,

馬鈴薯、瓊脂。孟加拉紅，青霉素，鏈霉素，甲基藍，蛋白陳，酵母

膏,蔗糖,磷酸鹽,葡萄糖,瓊脂條,無菌水等。消毒劑：75%的乙醇,0.1%

升汞（HgCh）,次氯酸鈉溶液（含活性氯10%）,30%雙氧水。雙蒸水、

瓊脂糖,Tris飽和酚、筑基乙醇（B-Mercaptoethanol）,石英砂，

Tris飽和酚，氯仿，異戊醇，無水乙醇，硼酸，冰醋酸，氯化鈉，鹽

酸，氫氧化鈉，EDTA,CTABo

3.1.3.培養(yǎng)基：

馬鈴薯、葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基

馬鈴薯汁1000ml,葡萄糖20g,瓊脂20gA（注：取

去皮馬鈴薯200克,切成小塊,加水1000毫升煮沸30分

鐘，濾去馬鈴薯塊，將濾液補足至100。毫升，加葡萄糖2

0克，瓊脂15克，溶化后分裝，15磅滅菌30分鐘

察氏瓊脂培養(yǎng)基

M30g,NaN033g,MgSO4.7H200.5g,KC1

0.5g,FeSO4.7H200.01g,K2HPO,1g,瓊脂13g,蒸播水

1000ml,自然pH

沙氏培養(yǎng)基

蛋白陳lg,葡萄糖或麥芽糖4g,瓊脂1.5克，水100

m1o

制法:1將上述物質(zhì)稱好，放入水中煮沸溶解（不必調(diào)PH即

有5左右）分中號試管（約4毫升）包扎,高壓115c20分鐘。趁熱斜

好，凝固備用。

馬丁氏培養(yǎng)基

葡萄糖10g,蛋白陳5g,KH2P04lg,MgS0r7H2O

0.5g,1%孟加拉紅3.3mL,瓊脂20g,水1000mL,pH值自然。

抗生素用法與用量:培養(yǎng)基滅菌之后分裝前按鏈霉素40

U/mL,青霉素30U/mL用量加入，冷卻到45℃左右未凝固時加

入抗生素,混勻倒平板。

四.方法：

4.1.1采樣方法：

在校園內(nèi)找到銀杏、喜樹、桂花樹并用刀采集葉、莖、

根、皮、種子。

4.1.2樣品前解決：

分別取根、莖、葉、果實,用洗滌劑在自來水下洗凈。

老樹皮用75%酒精進行表面消毒后，用鑲子取出，于

酒精燈上燒灼15秒至表面焦糊，切成IXlcn?大小置于PDA固體培養(yǎng)

基上。

對于根、莖、葉、果實按下列程序進行表面消毒：

75%的酒精漂（浸）洗2-3min-*無菌水沖洗4—6次->0.1%升汞不同的

消毒時間（見表2-2,共設(shè)立7個梯度）一無菌水沖洗4—6次一用滅

菌濾紙吸干多余水分一無菌刀片將材料切成小塊將根、莖的表皮、韌

皮部、木質(zhì)部大體分開,并切成0.5X0.5cm2大小。

將果實的外種皮去掉，消毒之后將內(nèi)種皮去掉。

滅菌時一，瀝干的植物材料轉(zhuǎn)放到燒杯中，記好時間,

倒入消毒溶液,不時用玻璃棒輕輕攪動，以促進材料各部分與消毒溶

液充足接觸，驅(qū)除氣泡,使消毒徹底。在快屆時間之前1-2分鐘，開

始把消毒液傾入一備好的大燒杯內(nèi)，要注意勿使材料倒出，傾凈后立

即倒入無菌水，輕攪漂洗。滅菌時間是從倒入消毒液開始，至倒入無

菌水時為止。滅菌液要充足浸沒材料。寧可多用些滅菌液，切勿勉強

在一個體積偏小的容器中使用很多材料滅菌。

4.1.3內(nèi)生菌的分離方法：

將上述組織塊置于分離培養(yǎng)基上（每一平皿培養(yǎng)

5塊組織塊）于27℃恒溫培養(yǎng)，同時將上述消毒過程中最后一次沖洗

組織塊后的無菌水滴在培養(yǎng)基上平行培養(yǎng)，用以檢測消毒是否徹底。

觀測菌絲生長情況及污染情況。

4.1.4純化方法：

培養(yǎng)3-4天后及時采用尖端菌絲挑取法,挑取形

態(tài)不同的菌絲或菌落移種到新鮮PDA培養(yǎng)基上。純化3-4次以保證

所得菌落為純培養(yǎng)。

4.2形態(tài)鑒定方法：

4.2.1培養(yǎng)方法:

培養(yǎng)基:查氏培養(yǎng)基、沙氏培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基。

將4℃保存菌種活化2次；

將活化菌種分別點種PDA、沙氏、察氏平板，每反復(fù)

25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天；

然后進行菌落特性描述，取一個平行進行制片（膠

帶子粘片法），觀測個體形態(tài)；

另兩個平行繼續(xù)培養(yǎng)至14天,取出；

反復(fù)環(huán)節(jié)4,作為最終描述結(jié)果；

根據(jù)真菌分類鑒定手冊和相關(guān)資料分析確該菌的

歸屬。

4.2.2制片方法：

膠帶粘貼法：選用在顯微鏡油鏡下觀測細(xì)致不粗糙且粘性好的

膠帶。取一小段膠帶從菌落表面的中心向邊沿粘，75%乙醇固定，乳

酸石炭酸棉藍染色液染色，將粘有菌絲的一面向上，蓋上蓋玻片，于

顯微鏡下觀測產(chǎn)抱結(jié)構(gòu)等特性。

4.2.3鑒定標(biāo)準(zhǔn)：

觀測的要點：

4.2.4菌落宏觀形態(tài)：

大小:以菌落的直徑（mm）表達。

顏色:涉及菌落表面和背面的顏色,及色素是否滲入培養(yǎng)基。

菌落表面的紋飾：如皺紋、輻射溝紋、同心環(huán)、整個菌落致密或

疏松等。

菌落的質(zhì)地:氈狀、毯狀、絨毛狀、棉絮狀、粉粒狀、革質(zhì)狀、

有無成束狀或繩狀的氣生菌絲。

菌落的高度：扁平、凸起或隆起，及菌落中心部分狀況等。

菌落邊沿:全緣、鋸齒狀、樹枝狀等。

滲出物:菌落表面有無液滴及液滴的顏色等。

4.2.5個體形態(tài)：

菌絲的特性：表面性狀（粗糙或光滑），寬度等

分生抱子梗：分支情況--簡樸或復(fù)雜，輪生或單生等；長短;

基部粗糙或光滑等。

產(chǎn)胞結(jié)構(gòu)的形態(tài)特性：形狀，大小，著生狀況（位置，單生、互

生或成輪生體）

分生泡子的形態(tài)：形狀，大小，表面狀況，聚集方式（直鏈、斜鏈

或聚集成

頭）

4.3分子生物學(xué)鑒定：

4.3.1培養(yǎng)方法：

培養(yǎng)基成分與不加瓊脂的PDA固體培養(yǎng)基成分相同。將液體

培養(yǎng)基以100mL每瓶分裝至250mL三角瓶中，用8層紗布封口。12

1℃,蒸汽滅菌20min。

將菌絲致密的真菌接種到液體培養(yǎng)基中,于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中27℃、

120rpm培養(yǎng)5—7天。用兩層滅菌紗布過濾菌絲球，用無菌蒸儲水沖洗菌絲球5

次，避免培養(yǎng)基中的糖類和蛋白對DNA提取的影響。40c下烘干菌絲，但是不

要過于干燥，然后進行DNA的提取。

4.3.2基因組DNA的提取

DNA提取采用CTAB法。CTAB（cety1triethy1ammon

iumbromide,十六烷基三乙基澳化鏤）是一種去污劑，可溶解

細(xì)胞膜,它能與核酸形成復(fù)合物,在高鹽溶液中是可溶的，當(dāng)減少溶液

鹽濃度到一定限度時，從溶液中沉淀，通過離心可將CTAB與核酸的

復(fù)合物同蛋白質(zhì)、多糖類物質(zhì)分開，然后將CTAB與核酸的復(fù)合物沉

淀溶解于高鹽溶液，再加乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。C

TAB法的好處是能很好地去掉糖類雜質(zhì)，提取前期可得到高含量的

DNA0

用CTAB法提取材料DNA的具體環(huán)節(jié)如下：

將CTABbuffer在65c水浴鍋中預(yù)熱，研缽用液氮預(yù)冷；

取0.1g左右菌絲體，在液氮中迅速研磨成粉末后，迅

速加入5mL預(yù)熱的提取液及10口LB-筑基乙醇,混合均勻后把混合

液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中700PL/管；

于65℃水浴保溫0.5-1h,時間不能超過1.5h0保

溫期間要輕輕振搖幾次；

冷卻至室溫后，加入等體積（700jL）的飽和酚:氯仿:異戊

醇（25：24：1）,充足混勻后靜置lOmin。

離心（12023rpm,1Omin,室溫），去沉淀，將上清液轉(zhuǎn)

入干凈離心管中。

根據(jù)雜質(zhì)的去除情況反復(fù)環(huán)節(jié)4、5數(shù)次，直至無雜質(zhì)；

加入等體積氯仿:異戊醇（24：1）抽提一次以去除飽和酚，

離心（12023rpm,10min,室溫）；

將上清液逐滴加入兩倍體積的-20℃預(yù)冷無水乙醇，以沉淀

出DNA。室溫放置10-20min,可以過夜；

挑取或離心去上清液（10000rpm,5min）的方法取出D

NA；用75%乙醇洗滌兩次；

<10>37℃保溫箱中干燥后溶于適量的TE緩沖液中4℃?zhèn)溆谩?/p>

4.4所用引物

ITS5:GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG

ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC

4.4.1PCR反映條件：

體系：PCR反映體系為50PL體系,涉及：

1OXPCRbuffer：1/10

MgCl2:1.5

mM,

dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）：。各200PM,

Primerl0.2

uM,

Primer2。

0.2PM,

Taq酶:「2.5

U,

DNA模板：。約10

0ngo

4.4.2條件:擴增條件

預(yù)變性95℃5min

變性95℃Imin

A

復(fù)性5TCImin30?35個循環(huán)

延伸72℃Imin

延伸補齊72℃10min

4.4.3測序方法：送測序公司。

4.4.4序例分析：

五.結(jié)果及分析：

結(jié)果：實驗分離到兩種真菌

5.1八爪金盤分離到菌種查氏正反照

5.1.1菌落宏觀形態(tài)：

大小：菌落的直徑3.2(mm)。

顏色：涉及菌落表面棕黑色背面灰色，色素滲入培養(yǎng)基。

菌落表面的紋飾：如皺紋、整個菌落致密。

菌落的質(zhì)地：氈狀

菌落的高度：凸起或隆起。

菌落邊沿:鋸齒狀。

滲出物:菌落表面無液滴。

5.1.2個體形態(tài)：

菌絲的特性：表面粗糙。

分生抱子梗:分支復(fù)雜，輪生。

5.1.3分子生物學(xué)鑒定

通過PCR擴增和序列分析，送公司檢測得到的序列為：

TGAAGTTAAAAAGCGTAACAAGGTCTCCGTAGGTGAACCTGCGG

AGGGATCATTACAAGTGACCCCGGTCTAACCACCGGGATGTTCATAACCCTTT

GTTGTCCGACTCTGTTGCCTCCGGGGCGACCCTGCCTTCGGGCGGGGGCT

CCGGGTGGACACTTCAAACTCTTGCGTAACTTTGCAGTCTGAGTAAACT

TAATTAATAAATTAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCG

ATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAA

TCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCT

GTTCGAGCGTCATTTCACCACTCAAGCCTCGCTTGGTATTGGGCATCGC

GGTCCGCCGCGTGCCTCAAATCGACCGGCTGGGTCTTCTGTCCCCTAAGCGTT

GTGGAAACTATTCGCTAAAGGGTGTTCGGGAGGCTACGCCGTAAAAC

AACCCCATTTCTAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACT

TAAGCATATCAAAATCGGAGGAA

通過blast序列分析得到的結(jié)果為：

Distributionof100BlastHitsontheQuerySequence

Sequeneesproducingsignificantalignments:

MaxTotalQuetyEMax

DescnptionAccession

scorescorecoverv^ueident

FUncu加redfungusdoneL046」37-l22975-C01-unis18sribosomalRNAgeneDartiaiseauencerntemaJtransenbedspa8fl,5nbosomaiRNAs1035103598%0099%JF2891171

「Uncultured"nousdoneIQ42883~122~063~B08iniemal"anscnDedscacer1oartalsequence58snDosomalRNApletesequenceanain1035103598%0099%GO9994741

「CiassoonumsoSS-S1218sribosomalRNAoeneoaniaisequenceinternaltransalDedsoacer158sribosomalRNAcene.andinternaltransenbe1035103598%0099%GU797141.1

I-claOosoonuEtenuissiEum18srRNAoenemaeal).5.8SrRNAcene_28srRNAcenemaeahmlemallfanscnbedscacer1CTS1)andin【emaltransa1035103598%0.09$%03003311

「Unculturedsoilftjnousdone8L8218srigsomalRNAciene.partialsequence:internaltranscribedspacer1.5.8Sri&osomalRNAoene,3ndinternaltr1033103398%0.099%JQ666401.1

FUnailturedfungusdonet2Fc9418sribosomalRNAqene.partialsequence:internaltranscribedspacer1,5.8SribosomalRNAnene,andinternaltram1033103398%0.099%GU7216711

rUngjlturedfunousdonef!H0c5418snposomalRNAqenepartialseouencerntemaltransenaedspacer1.58SnoosomalRNAaeneandinternaltra1033103398%0.099%GU7215361

runcultufedfungusdonefTHOcOC18snsosomalRNAdoneDarttalseauenceinternaltransenzdspacer158snnosomalRNAoeneandtnlemaitra1033103398%0099%GU721633.1

FUnculhne。funoiisdone”HOC3118sn8somalRNAoeneDaealsequenceinlemaitransenoedsoacerL58SnoosomalRNAaeneaminternalira1033103398%0.099%GU721631.1

「UngjitwedNnousaoneH~HITC34118sribosomalRNAgene.DartaiseouenceJntemaitransai&edSDacef1.58sribosomalRNAoene.andinternalh1033103398%0.099%GU721540.1

「UnculturedftifiQusdonefTHITc24l18shOosomalRNAciene.oartiHernaltranscribedspacer1.5.8SribosomalRNAQene.andinternalti1033103398%0.099%GU7215271

rUncuMedfungusdonefTHITc4118SribosomalRNAQene,partialseouence：intemaltranscribedSDacer1.58SribosomalRNAaenaandinternaltrz1033103398%0.099%GU7215131

「Unculturedfunousdonet2FcO518srioosomalRNAQenepartialsequence-internaltranscriDedspacer1.58sribosomalRNAQeneandmtemaltram1033103398%0.099%GU7213401

rUnculturedtunpusdoneTSPF4618SnDosomalRMAaeneoaealseouencein但maltransenoedsoacer158Snt>osomalRW(]@n。andintomaitn1033103398%0099%FJ2135421

「UnculturedfunousdoneITS~118HR18sribosomalRNAoeneDartiaiseau-ntemanransengdsoace，158snbosomaiRNaoene.andinternal1033103398%0099%EU718665.1

「UncultwedsoilfuncalRNAoene.andiNemaltr1031103198%0.099%JQ6664O9.1

UnculturedfunguscloneL046937-122-075-C01-unis18SribosomalRNAgene,partial

sequence;internaltranscribedspacer1,5.8SribosomalRNAgene,andinternal

transcribedspacer2,completesequence;and28SribosomalRNAgene,partial

sequence

GenBankJF2891171

FASTAGraphicsPooSet

602bpDMAlinearENV02-NOV-2011

DEFINITIONUnculturedfunguscloneL046937-122-075-C01-unis18SribosomalRNA

gene,partialsequence;internaltranscribedspacer1,5.8S

ribosomalRNAgene,andinternaltranscribedspacer2,complete

sequence;and28SribosomalRNAgene,partialsequence.

ACCESSIONJF289117

VERSIONJF289117.1GI:354720374

KEYWORDSENV.

SOURCEunculturedfungus

ORGANISMuncultti工ed￡工二通九§

Eulcaryota;Fungi;environmentalsaicples.

REFERENCE1(bases1to602)

AUTHORSFrohllch-Nowoisky,J.,Burrows,S.M.,Xie,Z.,Engling,G.,

Solomon,P.A.,Fraser,M.P.,Mayol-Bracero,O.L.,Artaxo,P.,

Begerow,D.,Conrad,R.,AndxeaezM.O.,Despres,V.R.andPoschl,U.

TITLEBiogeographyintheair:fungaldiversityoverlandandoceans

JOURNALBiogeosci.Discuss.8,7071-7096(2011)

REFERENCE2(bases1to602)

AUTHORSFrohlich-Nowoxsky,J.,Despres,V.R.andPoschl,U.

TITLEDirectSubmission

JOURNALSubmitted(01-FEB-2011)Biogeochemistry,MaxPlanckInstitutefor

Chemistry,Joh.-Joachim-Becher-Weg27,Mainz55128,Germany

FEATURESLocacion/Qualifiers

source1..602

/organ!sm="unculturedfungus"

/mol_zype="genomicDNA"