凋亡檢測實(shí)驗(yàn)第1頁，共24頁，2023年，2月20日，星期日主要內(nèi)容凋亡概述凋亡檢測方法的歷史沿革DNALadder實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)材料及試劑實(shí)驗(yàn)步驟及結(jié)果第2頁，共24頁，2023年，2月20日，星期日Apoptosis

NecrosisApoptosis(KerrandWyllie,1972)第3頁，共24頁，2023年，2月20日，星期日

Apoptosis

?Ageneticallyprogrammed,non-necroticcelldeath.Involvedintissuehomeostasis,celldifferentiation.Playmajorroleinavarietyofdiseases(e.g.Alzheimer,AIDS,heartfailureandcancer).第4頁，共24頁，2023年，2月20日，星期日凋亡與壞死的差別第5頁，共24頁，2023年，2月20日，星期日凋亡壞死胞體變小變大胞膜皺縮,形成空泡腫脹,通透性改變結(jié)局形成凋亡小體被鄰近細(xì)胞吞噬細(xì)胞崩解,引起炎癥反應(yīng)胞核涉及多個(gè)細(xì)胞,組織結(jié)構(gòu)被破壞濃縮,DNA斷裂成180～200bp或其倍數(shù)的片段與其他細(xì)胞關(guān)系不規(guī)則碎裂,溶解通常只影響散在單個(gè)細(xì)胞,組織結(jié)構(gòu)不被破壞第6頁，共24頁，2023年，2月20日，星期日ApoptoticAssay?Morphology

?DNAFragmentation?DNALadder?CaspaseActivity

?Anti-PARPwesternblot?CellMembraneAlteration

?PhosphotidylserineExposure第7頁，共24頁，2023年，2月20日，星期日第8頁，共24頁，2023年，2月20日，星期日第9頁，共24頁，2023年，2月20日，星期日第10頁，共24頁，2023年，2月20日，星期日第11頁，共24頁，2023年，2月20日，星期日ApoptoticAssay?Morphology?DNAFragmentation?DNALadder

?CaspaseActivity?Anti-PARPWesternblot?CellMembraneAlteration?PhosphotidylserineExposure第12頁，共24頁，2023年，2月20日，星期日endonucleaseGelelectrophoresis700520360180BasepairsDistancebetweencuts=mutipleof180bps180bps第13頁，共24頁，2023年，2月20日，星期日ApoptoticDNALadderLane1:MarkerLane2:negativecontrolLane3:DNAofapoptoticcellsLane4:DNAofnecrosiscells金標(biāo)準(zhǔn)第14頁，共24頁，2023年，2月20日，星期日實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)胞凋亡過程中,可發(fā)生特異性級(jí)聯(lián)生化反應(yīng),其中最具特色的是內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活.此酶可作用于連接DNA的核小體間區(qū)域,DNA鏈被切割成180~200bp或其整倍數(shù)的片斷.抽提DNA,經(jīng)瓊脂糖電泳可見梯狀電泳圖譜第15頁，共24頁，2023年，2月20日，星期日固定：

將細(xì)胞生前結(jié)構(gòu)和化學(xué)物質(zhì)雙重地保存下來，需要先固定。方法：1）物理固定，空氣干燥，

凍結(jié)干燥。2）化學(xué)固定，如甲醇，乙醇，丙酮，甲醛等。

第16頁，共24頁，2023年，2月20日，星期日實(shí)驗(yàn)步驟

獲取凋亡細(xì)胞抽提DNA瓊脂糖凝膠電泳第17頁，共24頁，2023年，2月20日，星期日實(shí)驗(yàn)步驟

取16g大小的小白鼠,外科手術(shù)取胸腺

少許洗去血跡放入研磨器中(160目)研磨,邊磨邊加1640液,獲取單個(gè)胸腺細(xì)胞.將所得混懸液倒入三角燒杯,加入120ml1640液(一般一只小白鼠可獲2x106/ml細(xì)胞)第18頁，共24頁，2023年，2月20日，星期日每孔加入1.2mlDEX(5mg/ml)混勻,co2培養(yǎng)箱,370c,5h取1ml混懸液,加入24孔培養(yǎng)板中將每孔細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新的Ep管中,3000rpm,5min,去上清,加入70%乙醇700ml混勻.震蕩打散細(xì)胞,-200c固定過夜

第19頁，共24頁，2023年，2月20日，星期日離心，3000rpm，5min,去上清（不要回倒，棉棒沾干液體，勿觸及沉淀）將上清轉(zhuǎn)入1.5mlEP管，離心12000rpm3min加400ul裂解液，加100ul蛋白酶k,混勻，600c水浴，30-45min

100ul飽和Nacl,充分震蕩，離心12000rpm3min第20頁，共24頁，2023年，2月20日，星期日將上清轉(zhuǎn)入無水乙醇管，顛倒離心管數(shù)次可見白色絮狀物（DNA）離心12,000rpm，1min，棄上清，并用棉簽吸干殘留的無水乙醇析出的DNA應(yīng)成小白點(diǎn)狀沉淀于管底，如貼附于管壁，加溶解液時(shí)應(yīng)小心。第21頁，共24頁，2023年，2月20日，星期日取凝膠到凝膠成像儀上拍照分析加入20ul溶解液至管中，反復(fù)吸打數(shù)次至DNA溶解電泳80v,1h吸出20ul已溶解的凋亡細(xì)胞DNA，加入到2%瓊脂糖凝膠孔電泳第22頁，共24頁，2023年，2月20日，星期日1.取出胸腺后,一定要注意將組織去除干凈。2.樣本須先經(jīng)70%乙醇固定,以防止DNA降解。3.70%乙醇,無水乙醇應(yīng)-200c預(yù)冷。4