本章節(jié)重點(diǎn)：離心沉降公式推導(dǎo)及應(yīng)用；離心設(shè)備分類及工作原理；細(xì)胞破碎普通方法及原理。細(xì)胞分離和破碎第1頁(yè)經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵或動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)得到原料液，應(yīng)首先將其中菌體或細(xì)胞與培養(yǎng)液分離。假如目標(biāo)產(chǎn)物為胞外物，可直接利用培養(yǎng)液進(jìn)行以后分離純化操作；假如目標(biāo)產(chǎn)物為胞內(nèi)物，則要對(duì)菌體或細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)處理，釋放目標(biāo)產(chǎn)物，然后除去細(xì)胞或其碎片，再進(jìn)行目標(biāo)產(chǎn)物分離純化。本章介紹細(xì)胞分離、目標(biāo)產(chǎn)物釋放以及蛋白質(zhì)復(fù)性主要方法和原理。概述細(xì)胞分離和破碎第2頁(yè)1.1重力沉降重力沉降在化工操作過(guò)程中慣用氣-固、液-固和液-液分離伎倆，在生物分離過(guò)程中亦有較多應(yīng)用1細(xì)胞分離細(xì)胞分離和破碎第3頁(yè)以液固沉降為例，重力沉降過(guò)程中固體顆粒受到重力、浮力和阻力作用。

阻力浮力重力細(xì)胞分離和破碎第4頁(yè)1.滯留區(qū)：stokes方程10-4<Re<1沉降速度2.過(guò)渡區(qū)：Allen公式1<Re<103沉降速度3湍流區(qū)：Newton公式103<Re<2×105沉降速度細(xì)胞分離和破碎第5頁(yè)普通而言單體細(xì)胞直徑小、沉降速度很低，滿足10-4<Re<1，可使用公式計(jì)算當(dāng)顆粒濃度較大時(shí)，顆粒之間相互碰撞相干擾，影響沉降速度。此時(shí)，顆粒沉降速度比單一顆粒小，需用空隙率函數(shù)f(ε):校正為懸浮液空隙率細(xì)胞分離和破碎第6頁(yè)

菌體和動(dòng)植物細(xì)胞重力沉降即使簡(jiǎn)便易行，但菌體細(xì)胞體積很小，沉降速度很慢。所以，實(shí)用上需使菌體細(xì)胞凝聚成較大顆粒后進(jìn)行沉降操作，提升沉降速度。在中性鹽作用下，可使菌體表面雙電層排斥電位降低，有利于菌體之間產(chǎn)生凝聚。細(xì)胞分離和破碎第7頁(yè)另外，向含菌體料液中加入聚丙烯酰胺或聚乙烯亞胺等高分子絮凝劑，可使菌體之間產(chǎn)生架橋作用而形成較大凝聚顆粒。凝聚或絮凝不但有利于重力沉降，而且還能夠在過(guò)濾分離中大大提升過(guò)濾速度和質(zhì)量。當(dāng)培養(yǎng)液中含有蛋白質(zhì)時(shí)．可使部分蛋白質(zhì)凝聚而同時(shí)過(guò)濾除去。細(xì)胞分離和破碎第8頁(yè)1.2離心沉降

離心沉降是科學(xué)研究與生產(chǎn)實(shí)踐中最廣泛使用非均相分離伎倆，不但適合用于菌體和細(xì)胞回收或除去，而且可用于血球、胞內(nèi)細(xì)胞器、病毒以及蛋白質(zhì)分離．也廣泛應(yīng)用于液---液相分離。細(xì)胞分離和破碎第9頁(yè)1.2.1離心沉降速度單位質(zhì)量物質(zhì)所受到離心力為：

其中N為轉(zhuǎn)速，r為離心機(jī)半徑離心設(shè)備一個(gè)主要技術(shù)指標(biāo)是：所能到達(dá)離心力與重力比值，稱為分離因數(shù)。分離因數(shù)是衡量離心程度參數(shù)r用z表示：細(xì)胞分離和破碎第10頁(yè)注意：科技文件中常將離心操作條件用多少g(如5000g、8000g等)表示．就是將離心力用Zg形式表示。將stokes公式中g(shù)用Zg代替，得到離心沉降速度vs公式：

或者：細(xì)胞分離和破碎第11頁(yè)需要注意一個(gè)公式：室溫下（20℃）某物質(zhì)在水中沉降系數(shù)：一些蛋白質(zhì)沉降系數(shù)表細(xì)胞分離和破碎第12頁(yè)1.2.2離心分離法（1）差速離心分級(jí)差速離心(Differentialcentrifugation)是生物化工最慣用離心分離方法。以菌體細(xì)胞搜集或除去為目標(biāo)固液離心分離是分級(jí)離心操作一個(gè)特殊情況，即為一級(jí)分組分離。細(xì)胞分離和破碎第13頁(yè)一些菌體細(xì)胞大小和離心操作條件細(xì)胞分離和破碎第14頁(yè)細(xì)胞分離和破碎第15頁(yè)(2)區(qū)帶離心區(qū)帶離心是生化工程中主要分離伎倆，依據(jù)離心操作條件不一樣，又分差速區(qū)帶離心和平衡區(qū)帶離心。兩種區(qū)帶離心法均事先在離心管中用某種低分子溶質(zhì)(如蔗糖溶液）調(diào)配好密度梯廢，在密度梯度之上加待處理料液進(jìn)行離心操作。二者區(qū)分在于溶質(zhì)密度梯度中與待分離物質(zhì)密度梯度不一樣。細(xì)胞分離和破碎第16頁(yè)區(qū)帶離心法可用于蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子分離純化，但處理量小，普通僅限于試驗(yàn)室水平。20世紀(jì)60年代人們開發(fā)了區(qū)帶轉(zhuǎn)子，利用其代替離心管，可增加處理能力。細(xì)胞分離和破碎第17頁(yè)1.2.3.離心分離設(shè)備試驗(yàn)室普通用轉(zhuǎn)子離心機(jī)。按速度分為低速離心機(jī)、高速離心機(jī)、超離心機(jī)。細(xì)胞分離和破碎第18頁(yè)

工業(yè)離心分離設(shè)備中，較為慣用有管式和碟片式兩大類.管式離心機(jī)工作原理：在離心力作用下．管內(nèi)液面旋轉(zhuǎn)軸為中心圓筒，將輕相（清液）和重相分離開來(lái)。缺點(diǎn)是沉降面積小．處理能力較低。細(xì)胞分離和破碎第19頁(yè)普通管式離心機(jī)工作參數(shù)：細(xì)胞分離和破碎第20頁(yè)碟片式離心機(jī)又稱板式離心機(jī)，離心轉(zhuǎn)子中有許多等間隔碟型分離板，以增大沉降面積和提升處理能力。操作過(guò)程，料液從中心進(jìn)料口輸入，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)子底部液孔進(jìn)入分離板外徑處，進(jìn)入分離板間隙。經(jīng)過(guò)分離板間隙向轉(zhuǎn)子中心移動(dòng)過(guò)程中，重相受離心力作用而沉降，輕相從轉(zhuǎn)子上部出口排出。連續(xù)操作時(shí)，重相從噴嘴連續(xù)噴出。碟片式離心機(jī)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，離心轉(zhuǎn)數(shù)普通較管式離心機(jī)低。細(xì)胞分離和破碎第21頁(yè)碟片式離心機(jī)工作示意圖細(xì)胞分離和破碎第22頁(yè)細(xì)胞分離和破碎第23頁(yè)碟式離心機(jī)是立式離心機(jī)一個(gè)，轉(zhuǎn)鼓裝在立軸上端，經(jīng)過(guò)傳動(dòng)裝置由電動(dòng)機(jī)驅(qū)動(dòng)而高速旋轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)鼓內(nèi)有一組相互套疊在一起碟形零件--碟片。碟片與碟片之間留有很小間隙。懸浮液（或乳濁液）由位于轉(zhuǎn)鼓中心進(jìn)料管加入轉(zhuǎn)鼓。當(dāng)懸浮液（或乳濁液）流過(guò)碟片之間間隙時(shí)，固體顆粒（或液滴）在離心機(jī)作用下沉降到碟片上形成沉渣（或液層）。沉渣沿碟片表面滑動(dòng)而脫離碟片并積聚在轉(zhuǎn)鼓內(nèi)直徑最大部位，分離后液體從出液口排出轉(zhuǎn)鼓。碟片作用是縮短固體顆粒（或液滴）沉降距離、擴(kuò)大轉(zhuǎn)鼓沉降面積，轉(zhuǎn)鼓中因?yàn)榘惭b了碟片而大大提升了分離機(jī)生產(chǎn)能力。積聚在轉(zhuǎn)鼓內(nèi)固體在分離機(jī)停機(jī)后拆開轉(zhuǎn)鼓由人工去除，或經(jīng)過(guò)排渣機(jī)構(gòu)在不停機(jī)情況下從轉(zhuǎn)鼓中排出。

細(xì)胞分離和破碎第24頁(yè)主要特點(diǎn)

1）分離能力強(qiáng)，分離因數(shù)在5000-9500之間；2）生產(chǎn)能力大，最高達(dá)10米3/小時(shí)；3）機(jī)動(dòng)性強(qiáng)，依據(jù)需要能夠自動(dòng)或手動(dòng)操作，也能夠?qū)崿F(xiàn)遠(yuǎn)距離自動(dòng)操作；4）維修方便主要用途

主要適合用于固形物在1-15%之間，固相顆粒直徑大于0.5微米液-液-固分離。比如油類：植物油、動(dòng)物油、魚油、乳油、原油、各種原料油、生物柴油、煤焦油、潤(rùn)滑油分離、澄清：乳品澄清；細(xì)胞分離和破碎第25頁(yè)利用薄片形多孔性介質(zhì)(如濾布)截留固液懸浮液中固體粒子，進(jìn)行固液分離方法過(guò)濾是一個(gè)膜分離法1.3過(guò)濾細(xì)胞分離和破碎第26頁(yè)濾液透過(guò)阻力主要來(lái)自于：過(guò)濾介質(zhì)和介質(zhì)表面堆積濾餅濾餅阻力是影響過(guò)濾速度主要原因提升過(guò)濾速度方法：

1）對(duì)濾液進(jìn)行絮凝或凝聚預(yù)處理，改變料液性質(zhì)2）在料液中加入助濾劑（如硅藻土）細(xì)胞分離和破碎第27頁(yè)2細(xì)胞破碎概述：許多生物產(chǎn)物在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中不能分泌到胞外培養(yǎng)液中，而保留在細(xì)胞內(nèi)。這類生物產(chǎn)物需用上節(jié)所述方法搜集菌體或細(xì)胞后，進(jìn)行細(xì)胞破碎(celldisruption)，使目標(biāo)產(chǎn)物選擇性地釋放到液相中。破碎細(xì)胞或其碎片利用上節(jié)所述固液分離方法(主要是離心法)除去后，上清液用于深入分離純化。細(xì)胞分離和破碎第28頁(yè)1）細(xì)胞壁動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)差異革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌之間差異細(xì)菌與真菌間差異2.1細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞分離和破碎第29頁(yè)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)2）細(xì)胞膜細(xì)胞分離和破碎第30頁(yè)磷脂分子由疏水和親水基團(tuán)組成。疏水基團(tuán)尾部有兩烷基基團(tuán)，親水基團(tuán)頭部有兩性基團(tuán)，或者說(shuō)是醇基，在內(nèi)膜層中，磷脂尾部聚集在一起，頭部暴露在水中，形成磷脂雙分子層。細(xì)胞分離和破碎第31頁(yè)原核細(xì)胞：細(xì)胞質(zhì)、核糖體真核細(xì)胞：細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器3）細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞分離和破碎第32頁(yè)生物產(chǎn)物存在地：細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器破碎目標(biāo)：破壞或破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，釋放其中目標(biāo)產(chǎn)物2.2細(xì)胞破碎和產(chǎn)物釋放原理細(xì)胞分離和破碎第33頁(yè)機(jī)理機(jī)械破碎法：壓縮力和剪切力破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)化學(xué)破碎法：1)改變細(xì)胞壁或膜結(jié)構(gòu)，增大胞內(nèi)物質(zhì)溶解速率2)完全溶解細(xì)胞壁，形成原生質(zhì)體，在滲透壓作用下使細(xì)胞膜破裂而釋放胞內(nèi)物質(zhì)細(xì)胞分離和破碎第34頁(yè)2.3細(xì)胞破碎技術(shù)2.3.1機(jī)械破碎（1）高壓勻漿（高壓剪切破碎）影響原因：壓力、循環(huán)操作次數(shù)和溫度適合用于酵母和大多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞團(tuán)狀和系狀菌易造成高壓勻漿器堵塞需要安裝冷卻裝置細(xì)胞分離和破碎第35頁(yè)（2）珠磨填充物為玻璃和氧化鋯（粒徑0.1~1.0mm）破碎效率歲攪拌速度和懸浮液停留時(shí)間增大而增大微珠粒徑于目標(biāo)細(xì)胞直徑比為30~100適合用于大多數(shù)微生物細(xì)胞，優(yōu)化設(shè)計(jì)過(guò)程復(fù)雜WSK臥式高效全能珠磨機(jī)ZM系列臥式密閉珠(砂)磨機(jī)細(xì)胞分離和破碎第36頁(yè)（3）噴霧撞擊破碎細(xì)胞破碎僅發(fā)生在與撞擊板撞擊一瞬間，細(xì)胞破碎程度均勻，破碎程度能夠經(jīng)過(guò)無(wú)極調(diào)整載氣壓力控制，防止細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞適合用于大多數(shù)微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞細(xì)胞分離和破碎第37頁(yè)（4）超聲波破碎超聲波作用下液體發(fā)生空化作用破碎程度于細(xì)胞種類、濃度、超聲波聲頻、聲能相關(guān)強(qiáng)烈破碎作用，適合用于大多數(shù)微生物細(xì)胞能量利用率低，過(guò)程產(chǎn)生大量熱聲波傳遞依照正弦曲線縱向傳輸，即一層強(qiáng)一層弱，依次傳遞，當(dāng)弱聲波信號(hào)作用于液體中時(shí)，會(huì)對(duì)液體產(chǎn)生一定負(fù)壓，即液體體積增加，液體中分子空隙加大，形成許許多多微小氣泡，而當(dāng)強(qiáng)聲波信號(hào)作用于液體時(shí)，則會(huì)對(duì)液體產(chǎn)生一定正壓，即液體體積被壓縮減小，液體中形成微小氣泡被壓碎。經(jīng)研究證實(shí)：超聲波作用于液體中時(shí)，液體中每個(gè)氣泡破裂會(huì)產(chǎn)生能量極大沖擊波，相當(dāng)于瞬間產(chǎn)生幾baidu高溫和高達(dá)上千個(gè)大氣壓，這種現(xiàn)象被稱之為---”空化作用”，

細(xì)胞分離和破碎第38頁(yè)方法技術(shù)原理效果成本舉例機(jī)械法高壓勻漿細(xì)胞被攪拌器劈碎適中適中酵母和大多數(shù)細(xì)菌珠磨破碎細(xì)胞被玻璃珠或鐵珠搗碎猛烈廉價(jià)細(xì)胞懸浮液和植物細(xì)胞大規(guī)模處理噴霧撞擊細(xì)胞高速凍結(jié)，撞擊撞擊板，發(fā)生破碎猛烈適中細(xì)胞懸浮液大規(guī)模處理超聲波用超聲波空穴作用使細(xì)胞破碎適中昂貴細(xì)胞懸浮液小規(guī)模處理細(xì)胞分離和破碎第39頁(yè)方法技術(shù)原理效果成本舉例化學(xué)法酸堿處理調(diào)整pH改變賀電性質(zhì)，使蛋白質(zhì)間作用力降低猛烈廉價(jià)化學(xué)試劑處理表面活性劑、螯合劑、鹽、有機(jī)溶劑處理，增大細(xì)胞壁通透性；變性劑破壞氫鍵作用猛烈適中脲、鹽酸胍用于細(xì)菌細(xì)胞酶溶細(xì)胞壁被消化，使細(xì)胞破碎溫和昂貴甘露糖酶處理酵母細(xì)胞2.3.2化學(xué)和生物化學(xué)滲透細(xì)胞分離和破碎第40頁(yè)堿處理法和酶消化法相反，反應(yīng)激烈，不具選擇性，而且較廉價(jià)。堿加入細(xì)胞懸浮液中后和細(xì)胞壁進(jìn)行了各種反應(yīng)，包含使磷脂皂化。該操作是細(xì)胞增溶很好例子，因?yàn)樗辜?xì)胞壁成份溶于表面活性劑，也使蛋白質(zhì)變性。該法不但破壞了細(xì)胞壁也破壞了產(chǎn)物，所以即便很廉價(jià)，堿處理是一個(gè)很不慣用方法。細(xì)胞分離和破碎第41頁(yè)滲透壓沖擊法

高——低滲透壓環(huán)境中轉(zhuǎn)化凍結(jié)——融化法1）破壞細(xì)胞膜疏水鍵結(jié)構(gòu)，增加親水性和通透性；

2）胞內(nèi)水結(jié)晶使胞內(nèi)外產(chǎn)生溶液濃度差，