肝細(xì)胞死亡的基礎(chǔ)與臨床研究第1頁/共38頁

內(nèi)容肝細(xì)胞死亡的模式肝細(xì)胞死亡與肝臟疾病

肝細(xì)胞死亡的調(diào)控

結(jié)論1234第2頁/共38頁

凋亡啟動(dòng)原因死亡受體/配體

DNA損傷生長因子缺乏主動(dòng)過程程序性細(xì)胞死亡

壞死繼發(fā)于重型病毒性肝炎

缺血/再灌注損傷

急性藥物性肝炎被動(dòng)過程顯著的炎癥反應(yīng)

肝細(xì)胞死亡的模式

肝細(xì)胞死亡第3頁/共38頁

細(xì)胞壞死與凋亡的形態(tài)區(qū)別第4頁/共38頁

舊觀點(diǎn)凋亡與壞死被認(rèn)為是兩種截然不同的現(xiàn)象

新觀點(diǎn)凋亡與壞死是源于相同啟動(dòng)因素和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的不同的細(xì)胞死亡方式，而線粒體功能損傷在這一過程中起到關(guān)鍵的連接作用。

第5頁/共38頁線粒體是細(xì)胞生命活動(dòng)的控制中心

氧化磷酸化中心

細(xì)胞凋亡調(diào)控中心

細(xì)胞呼吸鏈中心線粒體第6頁/共38頁凋亡存在兩條不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑一類細(xì)胞中含有足夠的Caspase8可被經(jīng)典的死亡受體活化，直接激活效應(yīng)Caspase；另一類細(xì)胞其死亡受體介導(dǎo)的Caspase8活化不能達(dá)到很高的水平，凋亡信號(hào)需要借助線粒體途徑來放大，而細(xì)胞色素C的釋放是這一途徑的關(guān)鍵步驟。

第7頁/共38頁

線粒體在凋亡中的作用第8頁/共38頁

缺血再灌注，肝細(xì)胞毒素（N-乙酰苯醌亞胺

NAPQI，膽酸，死亡受體活化等）集中作用于線粒體，導(dǎo)致其膜透化。

Bcl2家族成員包括caspase8活化形成的tBid,導(dǎo)致外膜透化。其透化可能包括外膜通道的形成或是線粒體腫脹破裂后誘導(dǎo)MPT。其他應(yīng)激因素可直接導(dǎo)致MPT.膜透化后，細(xì)胞色素C釋放相繼激活caspase9

和caspase3，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而由于線粒體功能的嚴(yán)重異常，ATP減少，caspase活化被阻斷則會(huì)發(fā)生壞死。壞死和凋亡是線粒體透化的不同結(jié)果第9頁/共38頁肝細(xì)胞死亡與肝臟疾病死亡受體/配體誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷1穿孔素/顆粒酶誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷2缺血/缺氧誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷3膽酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷4藥物誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷5第10頁/共38頁1.死亡受體/配體誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷目前認(rèn)為在肝臟中發(fā)揮重要作用的死亡受體主要包括Fas、TNFR1及TRAIL-R1/R2，后者與它們相應(yīng)的配體FasL、TNFα和TRAIL結(jié)合后可誘導(dǎo)受體發(fā)生寡聚化并活化其胞內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域，與相應(yīng)的連接蛋白相互作用進(jìn)而觸發(fā)凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。第11頁/共38頁1.死亡受體/配體誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷1.Fas/FasL誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷2.TRAILR/TRAIL誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷3.TNFR1/TNFα誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷第12頁/共38頁1）Fas/FasL誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷Fas在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、血竇內(nèi)皮細(xì)胞、星狀細(xì)胞及枯否氏細(xì)胞上具有廣泛的表達(dá)。

自然殺傷細(xì)（NK）和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）可通過分泌FasL啟動(dòng)凋亡程序來清除病毒感染的肝細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。第13頁/共38頁NK細(xì)胞殺傷自身肝細(xì)胞的機(jī)制Hepatology.2004JExpMed.2007Hepatology.2007第14頁/共38頁CTL細(xì)胞對(duì)肝細(xì)胞的殺傷作用第15頁/共38頁1）Fas/FasL誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷

研究發(fā)現(xiàn)乙型、丙型病毒性肝炎患者體內(nèi)可溶性Fas的表達(dá)有所增加，且表達(dá)水平與疾病活動(dòng)度及治療應(yīng)答反應(yīng)相關(guān)。當(dāng)HCV特異性的FasL表達(dá)的CTL被動(dòng)移植至穩(wěn)定表達(dá)HCV結(jié)構(gòu)蛋白的小鼠體內(nèi)后，小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)損傷，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）水平升高。在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中，HBV特異性CTL也能導(dǎo)致急性肝損傷甚至肝衰竭酒精性肝炎患者的血清中可以發(fā)現(xiàn)其可溶性Fas的表達(dá)也是上調(diào)的酒精和HCV病毒可在Fas信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)的肝臟損傷中發(fā)揮協(xié)同作用非酒精性脂肪肝患者中，其Fas的表達(dá)和肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生也是增加的。Fas誘導(dǎo)的凋亡在暴發(fā)性肝衰竭的發(fā)生發(fā)展中也占有一席之地

第16頁/共38頁2）TRAILR/TRAIL誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷

研究發(fā)現(xiàn)病毒性肝炎患者中其血清TRAIL的表達(dá)水平顯著增高；小鼠肝細(xì)胞在病毒感染后也能誘導(dǎo)上調(diào)TRAIL的表達(dá)，通過TRAILR/TRAIL途徑誘導(dǎo)感染肝細(xì)胞的凋亡。第17頁/共38頁Fas和TRAIL受體信號(hào)Fas和TRAIL的死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物(DISC)類似.TRAILR1/TRAIL-R2或Fas與其配體TRAIL或FasL結(jié)合后，通過與死亡結(jié)構(gòu)域(DD)的同型反應(yīng)招募調(diào)節(jié)蛋白FADD。FADD包含死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(DED)，可招募并分裂procaspase8和10,使其活化。Caspase8將Bid分裂為tBid，致使線粒體透化，功能失常和凋亡。第18頁/共38頁3）TNFR1/TNFα誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷正常肝細(xì)胞中TNFR1的表達(dá)水平很低，但各種急慢性肝臟疾病中，TNFR1會(huì)在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、血竇內(nèi)皮細(xì)胞和炎性浸潤細(xì)胞中大量表達(dá)。除了誘導(dǎo)凋亡途徑，TNFα還能通過NFκB依賴的基因表達(dá)途徑促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖，在部分肝切除后肝細(xì)胞的再生中起重要作用。TNFR表達(dá)過量時(shí)會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷加劇而肝臟再生失敗。

第19頁/共38頁3）TNFR1/TNFα誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷在肝臟移植中，供體與受體的TNFR1發(fā)揮相反的效應(yīng)，表現(xiàn)為供體TNFR1的缺陷可加劇移植物的損傷，而受體TNFR1缺陷時(shí)肝損傷有所緩和且炎性細(xì)胞浸潤減少。在酒精性肝炎患者中，其血清TNFα和TNFR1的水平均上升并與死亡率相關(guān)。病毒性肝炎患者中，其TNFα的水平與治療應(yīng)答反應(yīng)呈負(fù)相關(guān)。

第20頁/共38頁TNFa受體介導(dǎo)的信號(hào)TNF與TNFR結(jié)合后，與TRADD,RIP,TRAF-2共同形成ComplexI，激活NFkB和JNK.NFkB

激活某些survivalgene(包括抗凋亡蛋白c-FLIP,IAPs,Bcl-XL和A1)的轉(zhuǎn)錄。ComplexI經(jīng)過修飾和內(nèi)化形成ComplexII(DISC),后通過與DD的相互作用及激活procaspase8來招募FADD（Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域）?；罨腸aspase8將Bid（促凋亡蛋白）分裂為tBid,轉(zhuǎn)移至線粒體后導(dǎo)致其透化，功能障礙及凋亡。第21頁/共38頁2.穿孔素/顆粒酶誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷

穿孔素(perforin)主要存在于CTL和NK細(xì)胞的胞漿中,是CTL和NK細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒效應(yīng)的另一重要途徑。

第22頁/共38頁

2.穿孔素/顆粒酶誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷穿孔素可在靶細(xì)胞膜上形成跨膜孔道

1）引起細(xì)胞滲透性改變、鈣離子內(nèi)流和能量的耗竭，導(dǎo)致靶細(xì)胞融解和細(xì)胞死亡。

2）穿孔素形成的跨膜通道可以使顆粒酶（granzyme）進(jìn)入靶細(xì)胞，顆粒酶進(jìn)一步通過蛋白水解激活

Caspase家族的某些成員觸發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致靶細(xì)胞凋亡。第23頁/共38頁

2.穿孔素/顆粒酶誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷

研究發(fā)現(xiàn)，穿孔素在慢性乙肝肝細(xì)胞損傷中發(fā)揮了重要的作用，也是慢性丙肝患者肝細(xì)胞損傷的主要效應(yīng)分子。

第24頁/共38頁3.缺血/缺氧誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷

1.缺血-再灌注損傷

2.免疫凝血途徑誘導(dǎo)的肝細(xì)胞壞死第25頁/共38頁1）缺血-再灌注損傷發(fā)生于肝臟的缺血-再灌注損傷可分為兩個(gè)階段:第一階段反映了直接的肝細(xì)胞損傷。第二階段涉及到天然免疫系統(tǒng)的激活，特別是缺血后肝臟枯否氏細(xì)胞的活化，以及中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的炎性浸潤。第26頁/共38頁第27頁/共38頁缺血-再灌注損傷在肝細(xì)胞的體外熱缺血-再灌注損傷模型中，肝細(xì)胞急劇腫脹壞死。體內(nèi)肝臟發(fā)生缺血-再灌注損傷后，其急性階段也主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞的壞死。第28頁/共38頁缺血-再灌注損傷其他觀點(diǎn)

缺血-再灌注損傷后，肝細(xì)胞的凋亡和壞死是并存的，損傷的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間決定了細(xì)胞的死亡方式，即嚴(yán)重的損傷會(huì)導(dǎo)致早期發(fā)生的肝細(xì)胞壞死，而輕度的損傷則發(fā)生延遲的凋亡反應(yīng)。

第29頁/共38頁Serine89fgl2凝血酶原酶

屬于纖維蛋白原超家族，由活化巨噬細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，可直接催化凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘哪福瑥亩焖賳?dòng)凝血過程，促使纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，促進(jìn)血栓形成。Domain1N-terminalLinearProcoagulantDomain2C-terminalGlobularFRED免疫凝血途徑誘導(dǎo)的肝細(xì)胞壞死

第30頁/共38頁免疫凝血途徑誘導(dǎo)的肝細(xì)胞壞死

系列研究發(fā)現(xiàn)，活化巨噬細(xì)胞（內(nèi)皮細(xì)胞）/fgl2凝血酶原酶介導(dǎo)的免疫凝血途徑可通過促進(jìn)肝臟纖維素沉積和微血栓形成引發(fā)肝臟的微循環(huán)障礙，最終肝細(xì)胞缺血缺氧，ATP合成障礙而觸發(fā)肝細(xì)胞壞死的發(fā)生。

JVirol,1997,JImmunol1998,JClinInvest2003,中華醫(yī)學(xué)雜志２００３

WJG2006,HumanGeneTherapy2006，中化肝臟病雜志２００４，２００７JBiolChem.1999,andJBiolChem2003第31頁/共38頁KupfferCells/MacrophagesFulminantviralhepatitisapoptosisnecrosisCoagulatoinactivationFgl2prothrombinaseIFNHCFasLCaspasecascadeInflammationcytokinesFasCTLVirusVAgTCR肝內(nèi)枯否氏細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞fgl2高表達(dá)，是暴發(fā)性肝炎肝細(xì)胞壞死的重要機(jī)制第32頁/共38頁膽酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷體外細(xì)胞培養(yǎng)體系中，毒性膽鹽可以通過Fas或TRAIL依賴的途徑引起肝細(xì)胞凋亡。

在急性膽汁淤積的發(fā)生中，F(xiàn)as及其他信號(hào)途徑也能導(dǎo)致嚴(yán)重的線粒體功能障礙及ATP的耗竭，促進(jìn)細(xì)胞壞死的發(fā)生。

第33頁/共38頁藥物誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷在美國對(duì)乙酰氨基酚的過量使用是造成急性藥物性肝損傷的主要原因

肝細(xì)胞凋亡與壞死共存于對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝損傷：

1）當(dāng)藥物造成了ATP的完全耗竭，肝細(xì)胞壞死發(fā)生；

2）當(dāng)D-果糖與甘氨酸的運(yùn)用減緩了ATP的耗竭，則Caspase誘導(dǎo)的凋亡途徑占優(yōu)勢。

第34頁/共38頁

肝細(xì)胞死亡的調(diào)控1.正常