其他診斷專題知識講座其他診斷專題知識講座第1頁全國高等醫(yī)藥院校教材-分子診療學(xué)第一節(jié)

分子診療在移植配型中應(yīng)用

——HLA分子生物學(xué)分型第二節(jié)

分子診療在法醫(yī)學(xué)判定中應(yīng)用第三節(jié)

單核苷酸多態(tài)性分析其他診斷專題知識講座第2頁第一節(jié)

分子診療在移植配型中

應(yīng)用—HLA分子生物學(xué)分型

一、HLA遺傳學(xué)基礎(chǔ)Humanleucocyteantigen人類白血病抗原全國高等醫(yī)藥院校教材-分子診療學(xué)其他診斷專題知識講座第3頁一、HLA與器官移植

基礎(chǔ)概念

①組織相容性（histocompatibility）器官或組織移植時(shí)供者與受者相互接收程度，不相容就會(huì)出現(xiàn)排斥反應(yīng)（rejection），誘導(dǎo)排斥反應(yīng)抗原稱為組織相容性抗原，也稱為移植抗原。其他診斷專題知識講座第4頁②主要組織相容性抗原（MHA）主要組織相容性抗原

Majorhistocompatibilityantigen次要組織相容性抗原人類白細(xì)胞抗原

HLA

Humanleukocyteantigen其中與移植排斥相關(guān)主要為HLA-Ⅰ類和Ⅱ類抗原。

其他診斷專題知識講座第5頁③主要組織相容性復(fù)合體（MHC）編碼MHA(在人為HLA)基因是一組呈高度多態(tài)性基因群，集中分布于染色體上特定區(qū)域，稱為主要組織相容性復(fù)合體（majorhistocompatibilitycomplex，MHC），MHC編碼產(chǎn)物稱為MHC分子。其他診斷專題知識講座第6頁

抗原

免疫系統(tǒng)抗原肽－MHCⅡ/Ⅰ分子復(fù)合物免疫應(yīng)答CD4+/CD8+T細(xì)胞（細(xì)胞免疫、體液免疫）

抗原性異物排除◆

MHC分子為T細(xì)胞分化發(fā)育所必需

◆

MHC分子為免疫應(yīng)答開啟和調(diào)整所必需其他診斷專題知識講座第7頁其他診斷專題知識講座第8頁(一)MHC/HLA基因組成

人類MHC又稱為HLA基因復(fù)合體，位于第6對染色體短臂6p21.3上，約4000kb。HLA基因有七大類：即A，B，C，D，DR，DQ，DP。這七大類座位內(nèi)又有不一樣位點(diǎn)。依據(jù)編碼分子功效和分布不一樣，可將整個(gè)復(fù)合體基因分成三類：Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類基因。全國高等醫(yī)藥院校教材-分子診療學(xué)其他診斷專題知識講座第9頁其他診斷專題知識講座第10頁其他診斷專題知識講座第11頁其他診斷專題知識講座第12頁HLA基因分類

分類

基因座位

Ⅰ類基因

HLA-A-B-C

HLA-E-F-G-H-XⅡ類基因

HLA-DP-DQ-DR

HLA-DN-DO-DMⅢ類基因

位于Ⅰ和Ⅱ類基因之間主

要編碼一些補(bǔ)體和炎癥因

子（如：C4A，

C4B，

C2，Bf等補(bǔ)體組分）其他診斷專題知識講座第13頁HLA抗原分布HLA-I類抗原分布于有核細(xì)胞表面；HLA-II類抗原主要表示在活化Mφ、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞及活化T細(xì)胞表面。HLA-III主要是一些補(bǔ)體成份：如C2、C4、Bf等。其他診斷專題知識講座第14頁MHCclassIproteinsformafunctionalreceptoronmostnucleatedcellsofthebody.其他診斷專題知識講座第15頁Thereare3majorand2minorMHCclassIIproteinsencodedbytheHLA.ThegenesoftheclassIIcombinetoformheterodimeric(αβ)proteinreceptorsthataretypicallyexpressedonthesurfaceofantigenpresentingcells.其他診斷專題知識講座第16頁其他診斷專題知識講座第17頁（二）HLA遺傳特點(diǎn)1．單倍型遺傳

haplotype因?yàn)橐粭l染色體上HLA各位點(diǎn)距離非常近，極少發(fā)生同源染色體之間交換，所以親代HLA以單倍型為單位將遺傳信息傳給子代。

ABabGHghABGHABghababGHgh（1）（2）（3）（4）全國高等醫(yī)藥院校教材-分子診療學(xué)其他診斷專題知識講座第18頁其他診斷專題知識講座第19頁其他診斷專題知識講座第20頁2．共顯性遺傳

共顯性（co-dominance）是指某位點(diǎn)等位基因均能同等表示，二者編碼產(chǎn)物都可在細(xì)胞表面檢測到。多數(shù)個(gè)體HLA位點(diǎn)都是雜合子，但當(dāng)父親和母親在某位點(diǎn)上含有相同等位基因時(shí)，其子代這個(gè)位點(diǎn)就成為純合子。其他診斷專題知識講座第21頁CodominantexpressionofHLAgenes其他診斷專題知識講座第22頁其他診斷專題知識講座第23頁3．連鎖不平衡

理論上，一個(gè)HLA位點(diǎn)等位基因與另一個(gè)或幾個(gè)位點(diǎn)等位基因在某一單倍型出現(xiàn)頻率應(yīng)等于各自頻率乘積。然而實(shí)際情況是，在不一樣地域或不一樣人群，一些基因相伴出現(xiàn)頻率尤其高，這種現(xiàn)象稱為連鎖不平衡。已經(jīng)發(fā)覺一些疾病發(fā)生與HLA復(fù)合體中一些特定等位基因親密相關(guān)。其他診斷專題知識講座第24頁二、分子生物學(xué)分型法

1.RFLP與PCR-RFLP分型法

將目標(biāo)基因片段PCR擴(kuò)增后，利用各種限制性內(nèi)切酶對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，不一樣基因序列會(huì)產(chǎn)生不一樣酶切產(chǎn)物，從而產(chǎn)生不一樣電泳圖譜。它以簡單、敏感、準(zhǔn)確，無需同位素等優(yōu)點(diǎn)成為當(dāng)前較常見HLA基因分型技術(shù)之一，不過無法分辨雜合子，且只能區(qū)分有限多態(tài)性。全國高等醫(yī)藥院校教材-分子診療學(xué)其他診斷專題知識講座第25頁2.PCR-SSP分型法[等位基因特異性PCR（ASPCR）]

設(shè)計(jì)出一整套等位基因組特異性引物（sequencespecificprimer,SSP），借助PCR技術(shù)取得HLA型特異擴(kuò)增產(chǎn)物，可經(jīng)過電泳直接分析帶型決定HLA型別，從而大大簡化了試驗(yàn)步驟。優(yōu)點(diǎn)是簡單易行,分辨率可從低到高,成本低。缺點(diǎn)是不易自動(dòng)化;不能檢測新等位基因，試劑盒需不停升級。其他診斷專題知識講座第26頁3.PCR-SSCP分型法

假如二個(gè)HLA等位基因存在點(diǎn)突變，經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行聚丙烯酰凝膠電泳，因其序列差異形成不一樣空間構(gòu)象，則電泳遷移率也不一樣，如此可將它們區(qū)分開。PCR-SSCP作為PCR-SSO補(bǔ)充，有利于新HLA等位基因或突變體發(fā)覺，在區(qū)分純合子和雜合子基因方面有其獨(dú)到之處。其他診斷專題知識講座第27頁4.SBT分型法

SBT分型法——基于序列HLA分型法(Sequence-BasedHLATyping)，是通過對擴(kuò)增后HLA基因片段進(jìn)行核酸序列測定，從而判斷HLA型別方法。以上各個(gè)方法都存在一些缺點(diǎn)，如能配合使用，則能大大提升分型能力。其他診斷專題知識講座第28頁5.基因芯片技術(shù)我國生物芯片技術(shù)取得重大突破！由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所王升啟研究員領(lǐng)導(dǎo)課題組，與深圳益生堂生物企業(yè)有限企業(yè)聯(lián)合研制HLA-DRB1分型基因芯片試劑盒，于年9月取得了由國家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）頒發(fā)新藥證書和生產(chǎn)文號。這是在國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目和863計(jì)劃資助下，基因芯片技術(shù)應(yīng)用又一里程碑式重大結(jié)果。其他診斷專題知識講座第29頁其他診斷專題知識講座第30頁

移植配型(又稱為HLA配型/組織配型):指在器官移植中檢驗(yàn)供受者之間移植抗原（HLA）是否相配一系列辦法。當(dāng)前主要檢測是ABO抗原系統(tǒng)和HLA抗原系統(tǒng)。

HLA抗原系統(tǒng)主要進(jìn)行HLA-A、HLA-B和HLA--DR三對位點(diǎn)配型，只有兩個(gè)個(gè)體HLA配型完全相同才能進(jìn)行造血干細(xì)胞移植，不然會(huì)發(fā)生移植排斥反應(yīng)。全國高等醫(yī)藥院校教材-分子診療學(xué)三、HLA配型在器官移植中應(yīng)用其他診斷專題知識講座第31頁理論上說，同胞弟兄姐妹中有1/4機(jī)會(huì)HLA配型完全相合；兒女與父母之間只有二分之一HLA抗原相同，醫(yī)學(xué)上叫做半相合，通常不能相互移植。所以骨髓移植主要在同胞弟兄姐妹之間進(jìn)行。常見HLA分型，在300－500人就能夠找到相同者，少見HLA分型可能是萬分之一機(jī)率，而罕見就要到幾萬甚至幾十萬人群中尋找。其他診斷專題知識講座第32頁其他診斷專題知識講座第33頁

HLA抗原系統(tǒng)可經(jīng)過血清學(xué)方法、細(xì)胞學(xué)方法、分子生物學(xué)方法來檢測。

血清學(xué)分型借助是微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)或稱補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒試驗(yàn)。取已知HLA抗血清加入待測外周血淋巴細(xì)胞，作用后加入兔補(bǔ)體，充分作用后加入染料，著染細(xì)胞為死亡細(xì)胞，依據(jù)特異性抗體介導(dǎo)補(bǔ)體系統(tǒng)對靶細(xì)胞溶解原理，待檢淋巴細(xì)胞表面含有已知抗血清所針正確抗原。其他診斷專題知識講座第34頁細(xì)胞學(xué)分型技術(shù)指是經(jīng)過純合分型細(xì)胞及預(yù)致敏淋巴細(xì)胞試驗(yàn)對HLA分型。二種方法基礎(chǔ)原理均是判斷淋巴細(xì)胞在識別非己HLA抗原決定簇后發(fā)生增殖反應(yīng)。因?yàn)榉中图?xì)胞起源困難以及操作繁瑣，細(xì)胞學(xué)分型技術(shù)正逐步被淘汰。流式細(xì)胞術(shù)取之分子生物學(xué)分型法利用PCR技術(shù)將少許目標(biāo)DNA大量擴(kuò)增，然后再進(jìn)行產(chǎn)物判定方法，特點(diǎn)是靈敏度高，應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)。其他診斷專題知識講座第35頁尋求與受者M(jìn)HC相配供者組織或器官

1)

ABO血型相容試驗(yàn)：

2)

淋巴細(xì)胞毒交叉試驗(yàn)（MLR）：

+不宜移植受者血清+供者淋巴細(xì)胞-可行

3)

HLA定型或配型試驗(yàn)非家庭配型：表現(xiàn)型相同

MHCII(HLA-DR)配合優(yōu)于MHCI類

HLA-DR和HLA-DQ間連鎖不平衡其他診斷專題知識講座第36頁其他診斷專題知識講座第37頁第二節(jié)

分子診療

在法醫(yī)學(xué)判定中應(yīng)用提要：一、PCR技術(shù)在法醫(yī)判定中應(yīng)用二、DNA指紋圖譜技術(shù)三、STR位點(diǎn)分析四、DNA數(shù)據(jù)庫建立與

DNA數(shù)據(jù)交換五、性別判定與Y基因檢測全國高等醫(yī)藥院校教材-分子診療學(xué)其他診斷專題知識講座第38頁分子生物學(xué)優(yōu)點(diǎn)：

（1）檢材廣泛，穩(wěn)定性高（2）方法靈敏（3）高概率認(rèn)定全國高等醫(yī)藥院校教材-分子診療學(xué)其他診斷專題知識講座第39頁一、PCR技術(shù)在法醫(yī)判定中應(yīng)用親子判定：指在對父母和兒女之間親生關(guān)系（或稱為生物學(xué)關(guān)系）有所懷疑時(shí)，進(jìn)行遺傳關(guān)系方面檢驗(yàn)，方便確定親子關(guān)系是否存在，又稱為親權(quán)判定。個(gè)體識別：又稱個(gè)人同一認(rèn)定。即使二者判定目標(biāo)不一樣，但使用方法是一樣。全國高等醫(yī)藥院校教材-分子診療學(xué)其他診斷專題知識講座第40頁DNA提取

假如相匹配，將HLA分型與群體數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較

發(fā)出案例匯報(bào)，并給出隨機(jī)匹配概率

DNA定量

多個(gè)STR標(biāo)識PCR擴(kuò)增

待檢樣本HLA分型與其它結(jié)果比較

PCR產(chǎn)物分離與判定

確定HLA分型

圖15-1生物物證分析中HLA基因分型判定流程圖全國高等醫(yī)藥院校教材-分子診療學(xué)其他診斷專題知識講座第41頁二、DNA指紋圖譜技術(shù)一個(gè)DNA指紋能同時(shí)檢測十幾個(gè)甚至幾十個(gè)位點(diǎn)變異，反應(yīng)基因組信息非常豐富

DNA指紋圖譜由多個(gè)高變位點(diǎn)上等位基因形成，含有更高特異性嚴(yán)格遵照孟德爾遺傳規(guī)律，遺傳性簡單穩(wěn)定

DNA指紋圖譜含有體細(xì)胞穩(wěn)定性全國高等醫(yī)藥院校教材-分子診療學(xué)其他診斷專題知識講座第42頁三、STR位點(diǎn)分析STRs是首選群體遺傳學(xué)和法醫(yī)學(xué)研究遺傳標(biāo)志物美國聯(lián)邦數(shù)據(jù)庫（CombinedDNAIndexSystem,CODIS）公布13個(gè)STR位點(diǎn)：

D3S1358、VWA、FGA、D8S1179、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、THO1、TPOX、CSF1PO

AMEL（性別確定基因）

全國高等醫(yī)藥院校教材-分子診療學(xué)其他診斷專題知識講座第43頁其他診斷專題知識講座第44頁其他診斷專題知識講座第45頁其他診斷專題知識講座第46頁其他診斷專題知識講座第47頁其他診斷專題知識講座第48頁其他診斷專題知識講座第49頁其他診斷專題知識講座第50頁AMEL（性別確定基因）Thegeneforamelogenin（牙釉蛋白）canbeusedinsexdeterminationofsamplesfromunknownhumanoriginthroughthePolymeraseChainReaction(PCR).Usingprimersspecificforintron1ofthegene,thegenesequencefortheintroncanbeamplified.TheXchromosomegene,AMELX,givesrisetoa106bpamplificationproduct(amplicon)andtheYchromosomegene,AMELY,a112bpamplicon.Hence,theAMELXcontainsa6bpdeletioninthein