基因工程期末考材料題型：術(shù)語解釋、簡答題、論述題、可能有選擇題或填空等。

試卷一一、術(shù)語解釋（30分，每題3分,作于答題紙）cDNA：cDNA是由mRNA通過反轉(zhuǎn)錄酶合成的雙鏈DNA。cccDNA:CCCDNA是游離于染色體之外的質(zhì)粒雙鏈閉合環(huán)形DNA?；蛭膸欤夯蛭膸熘改硞€生物的基因組DNA或cDNA片段與適當?shù)妮d體在體外通過重組后，轉(zhuǎn)化宿主細胞，并通過一定的選擇機制篩選后得到大量的陽性菌落或噬菌體），所有菌落或噬菌體的集合。生物芯片：生物芯片（Biochip）是指通過機器人自動印跡或光引導(dǎo)化學合成技術(shù)在硅片、玻璃、凝膠或尼龍膜上制造的生物分子微陣列，根據(jù)分子間的特異性相互作用的原理，將生命科學領(lǐng)域中不連續(xù)的分析過程集成于芯片表面，以實現(xiàn)對細胞、蛋白質(zhì)、基因及其它生物組分的準確、快速、大信息量的檢測。感受態(tài)細胞（competentcell）:能夠吸收DNA的細胞，稱作感受態(tài)細胞competentcell）。DNA探針：是帶有標記的一段已知序列DNA，用以檢測未知序列、篩選目的基因等方面廣泛應(yīng)用。穿梭載體：穿梭載體是能夠在兩類不同宿主中復(fù)制、增殖和選擇的載體。篩選標記基因：篩選標記主要用來區(qū)別重組質(zhì)粒與非重組質(zhì)粒，當一個外源DNA片段插入到一個質(zhì)粒載體上時，可通過該標記來篩選插入了外源片段的質(zhì)粒，即重組質(zhì)粒。藍-白斑篩選:含LacZ基因（編碼6半乳糖苷酶）該酶能分解生色底物X-gal（5液-4-氯-3-吲哚-6-D-半乳糖苷）產(chǎn)生藍色，從而使菌株變藍。當外源DNA插入后，LacZ基因不能表達，菌株呈白色，以此來篩選重組細菌。稱之為藍白斑篩選?；虿僮鳎╣enemanipulation）:是指對基因進行分離、分析、改造、檢測、表達、重組和轉(zhuǎn)移等操作的總稱。二、簡答題（55分，作于答題紙）何謂Klenow片斷？Klenow片斷在基因工程中有哪些用途？（8分）KlenowDNA聚合酶是E.coliDNApolymeraseI經(jīng)蛋白酶（枯草桿菌蛋白酶）裂解而從全酶中除去5'--3'外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和3'--5'外切活性不受影響。也稱為Klenow片段（Klenowfragment），或E.coliDNA聚合酶I大片段（E.coliDNApolymeraseIlargefragment）。它也可以通過基因工程得到，分子量為76kDa。KlenowDNA聚合酶的活性與E.coliDNA聚合酶I的活性是一致的。由于沒有5'--3'外切活性，使用范圍進一步擴大。補平3'凹端DNA。使用單純的DNA合成活性。注意要加足夠的dNTP；如果使用帶標記的dNTP，則可對DNA進行末端標記。抹平DNA3'凸端。在3'--5'外切活性作用下，可切除突出的3'凸端。注意必須加足量dNTP，否則外切活性不會停止。但由于T4和T7DNA聚合酶具更強的3'--5'外切活性，現(xiàn)在已經(jīng)取代了KlenowDNA聚合酶的這一作用。通過置換反應(yīng)對DNA進行末端標記。但是該作用也已經(jīng)被T4或T7DNA聚合酶代替；它還可以在補平3'凹端的過程中進行標記。在cDNA克隆中合成第二鏈。隨機引物標記。應(yīng)用于Sanger雙脫氧鏈末端終止法的DNA測序（已經(jīng)被T7DNA聚合酶取代）。應(yīng)用于PCR反應(yīng)，現(xiàn)在已經(jīng)被TaqDNA聚合酶等取代。在體外誘變中，用于從單鏈模板合成雙鏈DNA。2、什么是“星星活性”？請簡述酶切時如何避免產(chǎn)生星星活性”現(xiàn)象。（8分）（staractivity）在極端非標準條件下，限制酶能切割與識別序列相似的序列，這個改變的特殊性稱星號活性。引起星星活性的因素有廿油濃度高＞5%），酶過量（＞100U/1），離子強度低（＜25mM），pH值過高（＞8.0），或是加了有機溶劑如PMSD（二甲基亞砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethbylformamide）、sulphalane等等，或是用其它二價陽離子如Mn++、Cu++、Co++或Zn++代替了Mg++。但不同的酶對上述條件的敏感性不一樣，如為口比EcoR!對高pH更敏感，但后者對廿油濃度更敏感。抑制星星活性的措施有許多，如減少酶的用量（可避免過份酶切）減少廿油濃度，保證反應(yīng)體系中無有機溶劑或乙醇，提高離子強度到100?150mM（如果不會抑制酶的活性的話），降低反應(yīng)pH至pH7.0，以及保證使用Mg++作為二價陽離子。PCR技術(shù)的工作原理是什么？用T—載體克隆PCR產(chǎn)物的原理是什么。（8分）經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆基因?它包括三個基本步驟：?（1）變性（Denature）:目的雙鏈DNA片段在94°C下解鏈；?（2）退火（Anneal）:兩種寡核苷酸引物在適當溫度（50C左右）下與模板上的目的序列通過氫鍵配對；?（3）延伸（Extension）:在TaqDNA聚合酶合成DNA的最適溫度下，以目的DNA為模板進行合成.?由這三個基本步驟組成一輪循環(huán)理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴增一倍TaqDNA聚合酶具有末端轉(zhuǎn)移酶的活性，可在DNA片段的3'末端添加一個核苷酸，通常為A。因此，TaqDNA聚合酶擴增的產(chǎn)物可與T-載體進行粘端互補連接，達到高效克隆的目的°T-載體最初由Promega公司開發(fā)出商品，并一直沿用到現(xiàn)在，如和pGEM-TEasy（圖5-2）。這些載體特點是，將普通的克隆載體切成線狀，并使之在3'末端含有一個凸出堿基T。pGEM-T是在pGEM-5Zf（+）基礎(chǔ)上改造而來的，即在其多克隆位點中的EcoRV處將載體切成平末端的線狀DNA，再在其3'末端添加一個T堿基。在DNA的3'末端添加一個T堿基的方法有很多，如用末端轉(zhuǎn)移酶和底物ddTMP可以產(chǎn)生單個T的突出末端；有些識別不對稱序列的限制性內(nèi)切酶，如MboII、Xcm!和Hph!，在切割DNA后可直接產(chǎn)生一個3'突出的T；用TaqDNA聚合酶和高濃度的dTTP也可產(chǎn)生3'突出的T。請簡述在進行RNA操作時該如何避免mRNA降解。（8分）由于mRNA分子的結(jié)構(gòu)特點,容易受RNA酶的攻擊反應(yīng)而降解，加上RNA酶極為穩(wěn)定且廣泛存在，因而在提取過程中要嚴格防止RNA酶的污染，并設(shè)法抑制其活性這是本實驗成敗的關(guān)鍵。所有的組織中均存在RNA酶，人的皮膚、手指、試劑、容器等均可能被污染，因此全部實驗過程中均需戴手套操作并經(jīng)常更換（使用一次性手套）所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200C烘烤2小時以上。凡是不能用高溫烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC^溶液處理,再用蒸餾水沖凈oDEPC是RNA酶的化學修飾劑，它和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)反應(yīng)而抑制酶活性。DEPC與氨水溶液混合會產(chǎn)生致癌物，因而使用時需小心。試驗所用試劑也可用DEPC處理，加入DEPC至0.1%濃度，然后劇烈振蕩10分鐘,再煮沸15分鐘或高壓滅菌以消除殘存的DEPC,否則DEPC也能和腺嘌吟作用而破壞mRNA活性。但DEPC能與胺和巰基反應(yīng),因而含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理。Tris溶液可用DEPC處理的水配制然后高壓滅菌。配制的溶液如不能高壓滅菌，可用DEPC處理水配制,并盡可能用未曾開封的試劑。除DEPC外,也可用異硫氰酸胍、釩氧核苷酸復(fù)合物、RNA酶抑制蛋白等。此外為了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上所有器皿一律需經(jīng)硅烷化處理。請簡述基因的結(jié)構(gòu)對基因操作的影響。（5分）（這一題下面答案寫的有點怪，大家自己參照課本第10、11頁)基因組序列：內(nèi)含子，外顯子mRNA/cDNA:G帽子polyA,UTR,ORF,請簡述堿裂解法從大腸桿菌中提取質(zhì)粒的原理。(8分)質(zhì)粒(Plasmid是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子大小從1-200kb不等，為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子,并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細胞中。從細菌中分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個基本步驟:培養(yǎng)細菌使質(zhì)粒擴增；收集和裂解細胞;分離和純化質(zhì)粒DNA。采用溶菌酶可以破壞菌體細胞壁，十二烷基磺酸^(SDS)和TritonX-100可使細胞膜裂解。經(jīng)溶菌酶和SDS或TritonX-100處理后，細菌染色體DNA會纏繞附著在細胞碎片上，同時由于細菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多,易受機械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。當用強熱或酸、堿處理時，細菌的線性染色體DNA變性，而共價閉合環(huán)狀DNA(CovalentlyclosedcircularDNA，簡稱cccDNA)的兩條鏈不會相互分開，當外界條件恢復(fù)正常時，線狀染色體DNA片段難以復(fù)性，而是與變性的蛋白質(zhì)和細胞碎片纏繞在一起而質(zhì)粒DNA雙鏈又恢復(fù)原狀，重新形成天然的超螺旋分子并以溶解狀態(tài)存在于液相中。7.哪些分子生物學的工具酶可用于DNA片斷的末端標記？(5分)Klenow片段DNA聚合酶IT4DNA聚合酶T7DNA聚合酶同多核苷酸激酶8.基因克隆的基本載體應(yīng)具備哪些元件？(5分)將外源DNA或基因攜帶入宿主細胞(hostcell)的工具稱為載體，載體是基因操作的核心工具?；蚬こ虒d體的要求(1)在宿主細胞內(nèi)能獨立復(fù)制(2)有選擇性標記(3)有一段多克隆位點外源DNA插入其中不影響載體的復(fù)制(4)分子量小，拷貝數(shù)多5)容易從宿主細胞中分離純化三、論述題(10分)典型的DNA重組實驗通常包括哪些步驟？⑴目的基因的獲得：■①從細胞中提取DNA；■②利用限制酶制備具有粘性末端或平端的目的DNA片斷；■③用機械方法剪切，如用超聲波斷裂DNA;■④經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶制備cDNA,如胰島素基因；■⑤用PCR拉出目的基因；■⑥根據(jù)肽鏈順序用DNA合成儀人工合成目的基因.體外重組黏性末端連接，如E.ccRIGAATTC平端連接，如HpaIGTTAAC和機械方法剪切，用連接酶連接；同聚末端連接，用脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(末端移酶)可在3、端合成低聚多核苷酸如pcly(T)和pcly(A),分別接在載體和目的基因上先形成氫鍵，再用連接酶連接.用人工接頭分子連接如人工合成的寡聚核苷酸接頭，限制酶識別位點等重組體導(dǎo)入宿主轉(zhuǎn)化(transformation):適合質(zhì)粒(plasmid)作載體；轉(zhuǎn)染(transfection):適合噬菌體作載體；轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction):適合噬菌體作載體；脂質(zhì)體-介導(dǎo)(liposome-mediated)基因轉(zhuǎn)移；微注射(microinjection):適合真核細胞；電穿孔(electroporation)法:適合真核細胞；基因槍(biolistics,genegun):適合植物細胞；重組體克隆的篩選與鑒定篩選陽性菌落或噬菌斑利用載體的遺傳標記如抗性；lac-Z顯色反應(yīng)遺傳互補DNA瓊脂糖電泳鑒定重組體菌落或噬菌斑原位分子雜交測序；b.免疫化學和其它產(chǎn)物分析方法外源基因表達產(chǎn)物的分離提純電泳過柱葡聚糖親和層析柱液相色譜五.綜合題(5分)認真閱讀后，請回答(可用英文作答)在94°C下，DNA以何種形態(tài)存在？(1分)退火時，在什么情況下單鏈的引物和單鏈的模板之間的氫鍵才不能斷裂(2分)？72C延伸時，DNA聚合酶是以何方向閱讀模板鏈的？DNA聚合酶在引物的哪一端力口dNTP?(2分)ThecyclingreactionsofPCR(PolymeraseChainReaction)Denaturationat94C:Duringthedenaturation,thedoublestrandmeltsopentosinglestrandedDNA,allenzymaticreactionsstop(forexample:theextensionfromapreviouscycle).Annealingat54C:Theprimersarejigglingaround,causedbytheBrownianmotion.Hydrogenbondsareconstantlyformedandbrokenbetweenthesinglestrandedprimerandthesinglestrandedtemplate.Themorestablebondslastalittlebitlonger(primersthatfitexactly)andonthatlittlepieceofdoublestrandedDNA(templateandprimer),thepolymerasecanattachandstartscopyingthetemplate.Oncethereareafewbasesbuiltin,thehydrogenbondissostrongbetweenthetemplateandtheprimer,thatitdoesnotbreakanymore.extensionat72C:Thisistheidealworkingtemperatureforthepolymerase.Theprimers,wherethereareafewbasesbuiltin,haveastrongerattractiontothetemplate,createdbyhydrogenbonds,thantheforcesbreakingtheseattractions.Primersthatareonpositionswithnoexactmatch,getlooseagain(becauseofthehighertemperature)anddon'tgiveanextensionofthefragment.Thebases(complementarytothetemplate)arecoupledtotheprimeronthe3'side(thepolymeraseaddsdNTP'sfrom5'to3',readingthetemplatefrom3'to5'side,basesareaddedcomplementarytothetemplate)答：(1)在94C下，DNA以何種形態(tài)存在？(1分)thedoublestrandmeltsopentosinglestrandedDNA,(2)退火時，在什么情況下單鏈的引物和單鏈的模板之間的氫鍵才不能斷裂(2分)？Oncethereareafewbasesbuiltin,thehydrogenbondissostrongbetweenthetemplateandtheprimer,thatitdoesnotbreakanymore.(3)72°C延伸時，DNA聚合酶是以何方向閱讀模板鏈的？DNA聚合酶在引物的哪一端加dNTP?(2分)thepolymeraseaddsdNTP'sfrom5'to3',readingthetemplatefrom3'to5'side,basesareaddedcomplementarytothetemplat.試卷二一、寫出下列英文縮寫字母所代表的中文含義(15分，每題0.5分)PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳TAE含EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸的電泳緩沖液EDTA二乙胺四乙酸TBETris-硼酸和EDTA的電泳緩沖液TPETris-磷酸和EDTAddNTP2',3'一雙脫氧核苷三磷酸cDNA互補DNAdsDNA雙鏈DNAEPO促紅細胞生成素HAS血清蛋白素TPA組織纖溶酶原激活劑RFDNA復(fù)制型DNAphagemid噬菌粒YAC酵母人工染色體BAC細菌人工染色體載體ampr氨芐青霉素抗性基因MSC多克隆位點BAP細菌的堿性磷酸酶CIP牛小腸堿性磷酸酶TdT末端轉(zhuǎn)移酶lacZ8-半乳糖苷酶基因AD轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域DBDDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域ori復(fù)制起點PCR聚合酶鏈式反應(yīng)BSA小牛血請白蛋白RNaseA核糖核酸酶ADNaseI脫氧核糖核酸酶IESC胚胎干細胞GST谷胱廿肽一S一轉(zhuǎn)移酶二、術(shù)語解釋20分轉(zhuǎn)基因動物：轉(zhuǎn)基因動物是指染色體基因組中整合有外源基因并能遺傳給后代的一類動物?；蛭膸欤褐改硞€生物的基因組DNA或cDNA片段與適當?shù)妮d體在體外通過重組后，轉(zhuǎn)化宿主細胞，并通過一定的選擇機制篩選后得到大量的陽性菌落(或噬菌體)所有菌落或噬菌體的集合。穿梭載體(Shuttlevector):是能夠在兩類不同宿主中復(fù)制、增殖和選擇的載體。生物芯片(Biochip):是指通過機器人自動印跡或光引導(dǎo)化學合成技術(shù)在硅片、玻璃、凝膠或尼龍膜上制造的生物分子微陣列，根據(jù)分子間的特異性相互作用的原理，將生命科學領(lǐng)域中不連續(xù)的分析過程集成于芯片表面，以實現(xiàn)對細胞、蛋白質(zhì)、基因及其它生物組分的準確、快速、大信息量的檢測。隨機引物：能與任何DNA模板的多個位點配對互補的多個不均一序列寡聚核苷酸DNA片斷叫隨機引物。探針：用作檢測的核酸片段即為探針（probe）。探針必須經(jīng)過標記，以便示蹤和檢測。同尾酶：許多不同的限制酶切割DNA產(chǎn)生的末端是相同的，且是對稱的，即它們可產(chǎn)生相同的粘性突出末端。這些酶統(tǒng)稱為同尾酶。粘性末端：識別位點為回文對稱結(jié)構(gòu)的序列經(jīng)限制酶切割后，產(chǎn)生的末端為匹配粘端，亦即粘性末端（cohesiveend），這樣形成的兩個末端是相同的，也是互補的。基因工程（geneticengineering）:就是在分子水平上，在體外對不同生物的遺傳物質(zhì)（基因）進行剪切、重組、連接，然后插入到載體分子中（細菌質(zhì)粒、病毒或噬菌體DNA），然后轉(zhuǎn)入微生物、植物或動物細胞內(nèi)，使外源DNA（基因）在收體細胞中進行復(fù)制和表達，按照人們的需要生產(chǎn)不同的產(chǎn)物或者定向地創(chuàng)造生物的新性狀，并能穩(wěn)定的遺傳給下代。星號活性（staractivity）:在極端非標準條件下，限制酶能切割與識別序列相似的序列，這個改變的特殊性稱星號活性。三、簡答題（40分）簡述瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定和純化DNA片段的原理以及影響DNA片段遷移速率的因素。?DNA和RNA實際上呈多聚陰離子狀態(tài)（Polyanions）。將DNA、RNA放到電場中，它就會由負極一正極移動。分子篩效應(yīng)。?瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì)其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場中,在中性pH值下帶負電荷的DNA向陽極遷移，其遷移速率由下列多種因素決定?1、DNA的分子大?。?線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。?2、瓊脂糖濃度?一個給定大小的線狀DNA分子，其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同°DNA電泳遷移率的對數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%,分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%,DNA片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。?3、DNA分子的構(gòu)象?當DNA分子處于不同構(gòu)象時它在電場中移動距離不僅和分子量有關(guān)還和它本身構(gòu)象有關(guān)。?4、電源電壓?在低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長片段越大，因場強升高引起的遷移率升高幅度也越大,因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達到最大所加電壓不得超過5v/cm。?5、嵌入染料的存在。熒光染料漠化乙啶用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使其剛性更強，還會使線狀DNA遷移率降低15%。?6、離子強度影響?電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時（如誤用蒸餾水配制凝膠），電導(dǎo)率最小,DNA幾乎不移動，在高離子強度的緩沖液中（如誤加10X電泳緩沖液），則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。2、簡述PCR技術(shù)的原理和基本步驟。（6分）

經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆基因?它包括三個基本步驟：?(1)變性(Denature):目的雙鏈DNA片段在94°C下解鏈;?(2)退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當溫度(50C左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對；?(3)延伸(Extension):在TaqDNA聚合酶合成DNA的最適溫度下，以目的DNA為模板進行合成.?由這三個基本步驟組成一輪循環(huán)理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴增一倍什么叫PCR擴增引物？簡述PCR引物設(shè)計時需要遵循的原則。?引物設(shè)計和選擇目的DNA序列區(qū)域時可遵循下列原則：(1)引物長度約為16-30bp,太短會降低退火溫度影響引物與模板配對，從而使非特異性增高。太長則比較浪費且難以合成。?(2)引物中G+C含量盡量控制在40%至60%之間，4種堿基的分布應(yīng)盡可能均勻。盡量避免嘌吟或嘧啶的連續(xù)排列，以及T在3‘末端的重復(fù)排列。(3)四種堿基應(yīng)隨機分布，引物的3‘末端最好是G或C，但在3’端不存在連續(xù)3個G或C,因這樣易導(dǎo)致錯誤引發(fā)。?(4)引物的解鏈溫度：兩個引物之間的Tm值差異最好在2-5C。?(5)避免引物內(nèi)部或引物之間存在互補序列(3個堿基)，從而減少引物二聚體的形成以及引物內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)的形成。((6)引物5‘端對擴增特異性影響不大可在引物設(shè)計時加上限制酶位點、核糖體結(jié)合位點、起始密碼子、缺失或插入突變位點以及標記生物素、熒光素、地高辛等通常應(yīng)在5’端限制酶位點外再加1-2個保護堿基。((7)引物不與模板結(jié)合位點以外的序列互補。所擴增產(chǎn)物本身無穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)。在RNA操作中，如何控制潛在的RNA酶活性。(8分)1、干烤耐熱器皿2、DEPC處理溶液3、低溫操作典型的真核轉(zhuǎn)錄因子，如GAL4、GCN4、等都含有二個不同的結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-bindingdomain)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcription-activatingdomain)。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可識別DNA上的特異序列并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)節(jié)的基因的上游?轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可同轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的其他成分作用，啟動它所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄。4、54、5.避免RNAase污染簡述酵母雙雜交技術(shù)的基本原理。(二個結(jié)構(gòu)域不但可在其連接區(qū)適當部位打開，仍具有各自的功能，但不能激活轉(zhuǎn)錄。只有當被分開的兩者通過適當?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時才能重新呈現(xiàn)完整的轉(zhuǎn)錄因子活性，并可激活上游激活序列(upstreamactivatingsequence,UAS)的下游啟動子，使啟動子下游基因得到轉(zhuǎn)錄。即不同兩結(jié)構(gòu)域可重建發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。(根據(jù)這個特性，構(gòu)建二類載體：(1、將編碼DNA-BD的基因與已知蛋白質(zhì)(Baitprotein)的基因構(gòu)建在同一個表達載體上，在酵母中表達兩者的融合蛋白BD-Baitprotein。(2、將編碼AD的基因和cDNA文庫的基因構(gòu)建在AD-LIBRARY表達載體上。(同時將上述兩種載體轉(zhuǎn)化改造后的酵母，這種改造后的酵母細胞的基因組中既不能產(chǎn)生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏這些營養(yǎng)的培養(yǎng)基上無法正常生長。(當上述兩種載體所表達的融合蛋白能夠相互作用時，功能重建的反式作用因子能夠激活酵母基因組中的報告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，從而通過功能互補和顯色反應(yīng)篩選到陽性菌落。(將陽性反應(yīng)的酵母菌株中的AD-LIBRARY載體提取分離出來，從而對載體中插入的文庫基因進行測序和分析工作。四、論述題（20分）1.請闡述一個好的表達載體需要具備哪些條件？各元件有何作用？（15分）?通過基本克隆載體上加上合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列即可使它變?yōu)楸磉_載體。?（1）在宿主細胞內(nèi)能獨立復(fù)制，具有自主復(fù)制的序列?（2）有選擇性標記編碼序列：（3）有一段多克隆位點外源DNA插入其中不影響載體的復(fù)制?（4）強啟動子，經(jīng)常是可誘導(dǎo)的，如lac或trp操縱子的啟動子或T7后期啟動子（T7RNA聚合酶基因從可誘導(dǎo)的啟動子表達）（5）轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，如核糖體結(jié)合位點，轉(zhuǎn)錄終止子2、比較在細菌、真核生物和動物個體中表達外源基因的優(yōu)缺點。大腸桿菌表達外源基因的優(yōu)勢?全基因組測序，共有4405個開放型閱讀框架全基因組測序，共有4405個開放型閱讀框架?基因克隆表達系統(tǒng)成熟完善基因克隆表達系統(tǒng)成熟完善?繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定?被美國FDA批準為安全的基因工程受體生物大腸桿菌表達外源基因的劣勢?缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能?缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)?內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白蛋白?細胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素酵母菌表達外源基因的優(yōu)勢?酵母菌是最簡單的真核模式生物全基因組測序，基因表達調(diào)控機理比較清楚，遺傳操作簡便?能將外源基因表達產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中?具有原核細菌無法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng)?大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久技術(shù)成熟、工藝簡單、成本低廉低廉?不含有特異性的病毒、不產(chǎn)內(nèi)毒素，美國FDA認定為安全的基因工程受體系KGenerallyRecognizedAsSafeGRAS）缺點：缺乏強啟動子、分泌效率差、表達質(zhì)粒不穩(wěn)定，但是酵母細胞不內(nèi)能提供哺乳動物蛋白功能所需的翻譯后加工生物反應(yīng)器a、產(chǎn)量高、成本低、周期短，效率高；b、乳腺表達、不影響動物整體；c、能彌補其它表達系統(tǒng)的不足，對蛋白可進行翻譯后修飾加工。d、從乳汁中純化蛋白技術(shù)簡單，不污染環(huán)境。e、改變?nèi)橹煞?，作為保健食品。缺點：技術(shù)不成熟，研發(fā)費用高。閱讀題（5分）（這一題沒題目，有考出來知道答案就行了。）Nodescendedfromthefertilizedegghavebeenproducedbymitosis.試卷三1、簡述基因工程對載體的要求。（15）?①分子較小，可攜帶比較大的DNA片段。?②能獨立于染色體而進行自主復(fù)制并且是高效的復(fù)制。?③要有盡可能多種限制酶的切割位點，但每一種限制酶又要最少的切割位點（多克隆位點multiplecloningsites，MCS）。?④有適合的標記，易于選擇。?⑤有時還要求載體要能啟動外源基因進行轉(zhuǎn)錄及表達，并且盡可能是高效的表達。?⑥從安全角度考慮，要求載體不能隨便轉(zhuǎn)移，僅限于在某些實驗室內(nèi)特殊菌種內(nèi)才可復(fù)制等等。2、什么叫a-互補？簡述基因工程中蘭白斑法篩選重組子的原理。（20）a-互補是指lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的P-半乳糖苷酶（|3-galactosidase，由1024個氨基酸組成）陰性的突變體之間實現(xiàn)互補。lacZ基因是乳糖lac操縱子中編碼p-半乳糖苷酶的基因，乳糖及其衍生物可誘導(dǎo)其表達。?乳糖既是lac操縱子的誘導(dǎo)物，也是作用的底物。?異丙基-P-D-硫代半乳糖苷（IPTG）是乳糖的衍生物，可作為lac操縱子的誘導(dǎo)物，但不能作為反應(yīng)的底物；5-漠-4-氯-3-吲哚-P-D-半乳糖苷（X-gal）可作為lac操縱子的底物，但不能作為誘導(dǎo)物。底物X-gal還可充作生色劑，被P-半乳糖苷酶分解后可產(chǎn)生蘭色產(chǎn)物，可使菌落或噬菌斑呈蘭色。?當外源DNA插入后，LacZ基因不能表達，菌株呈白色，以此來篩選重組細菌。稱之為藍-白斑篩選。3、載體、質(zhì)粒、cos位點、限制性核酸內(nèi)切酶、同裂酶、同尾酶的概念。（30）?載體是指基因工程中用來轉(zhuǎn)移外源DNA的一類DNA分子。?質(zhì)粒是染色體外能夠進行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細胞器和細菌細胞中擬核以外的脫氧核糖核酸（DNA）分子。cos位點（cohensive-endsite）:當入DNA進入細菌細胞后，便迅速通過黏性末端配對形成雙鏈環(huán)狀的DNA分子，這種黏性末端結(jié)合形成雙鏈的區(qū)域稱為cos位點。?簡稱限制性核酸酶。這是一類能從DNA分子中間水解磷酸二酯鍵