基因工程藥物的生產(chǎn)原理及其應(yīng)用摘要：近年來(lái)，基因工程藥物在目的基因制備、載體的構(gòu)建、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)、宿主表達(dá)系統(tǒng)和生物反應(yīng)發(fā)生器等方面取得了令人矚目的成就。本文簡(jiǎn)單介紹基因工程藥物的生產(chǎn)原理及其重要應(yīng)用。關(guān)鍵詞：基因工程藥物生產(chǎn)原理應(yīng)用隨著基因研究的深入，人類(lèi)已經(jīng)可以生產(chǎn)出許多基因工程產(chǎn)品?；蚬こ趟幬镆脶t(yī)藥產(chǎn)業(yè)，由此引起了醫(yī)藥工業(yè)的重大變革，使得醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)成為最活躍、發(fā)展最快的產(chǎn)業(yè)之一，同時(shí)大大提高了21世紀(jì)人類(lèi)的整體健康狀況?；蚬こ趟幬镉址Q(chēng)生物技術(shù)藥物是指利用基因工程技術(shù)研制和生產(chǎn)的藥物，是根據(jù)人們的愿望設(shè)計(jì)的基因，在體外剪切組合，并和載體DNA連接，然后將載體導(dǎo)入靶細(xì)胞（微生物、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或人體組織靶細(xì)胞），使目的基因在靶細(xì)胞中得到表達(dá)，最后將表達(dá)的目的蛋白質(zhì)純化及做成制劑，從而成為蛋白類(lèi)藥或疫苗。主要種類(lèi)有：胰島素、單克隆抗體、荷爾蒙、干擾素、白細(xì)胞介素、組織型纖溶酶原激活因子、紅細(xì)胞生成素、集落刺激因子。1生產(chǎn)原理基因工程制藥技術(shù)分獲取目標(biāo)基因的上游技術(shù)和大量培養(yǎng)上游技術(shù)階段。上游技術(shù)實(shí)質(zhì)就是基因工程技術(shù)。下游技術(shù)則包括菌體培養(yǎng)，細(xì)胞破碎，大量培養(yǎng)以及分離純化幾個(gè)步驟。1.1基因工程制藥的上游技術(shù)基因工程是生物工程的一個(gè)重要分支，它和細(xì)胞工程、酶工程、蛋白質(zhì)工程和微生物工程共同組成了生物工程。所謂基因工程是在分子水平上對(duì)基因進(jìn)行操作的復(fù)雜技術(shù)，是將外源基因通過(guò)體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)，使這個(gè)基因能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)的操作。它是用人為的方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質(zhì)——DNA大分子提取出來(lái)，在離體條件下用適當(dāng)?shù)墓ぞ呙高M(jìn)行切割后，把它與作為載體的DNA分子連接起來(lái)，然后與載體一起導(dǎo)入某一更易生長(zhǎng)、繁殖的受體細(xì)胞中，以讓外源物質(zhì)在其中“安家落戶(hù)”，進(jìn)行正常的復(fù)制和表達(dá)?；蚬こ萄芯坎捎玫募夹g(shù)方法很多，以下介紹常見(jiàn)基本兩種：聚合酶鏈反應(yīng)技和Sanger雙脫氫鏈終止法。1.1.1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其英文PolymeaseChainReaction（PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法。類(lèi)似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴(lài)于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火一延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93°C左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55C左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸：DNA模板一引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2?4分鐘，2?3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍現(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時(shí)在60°C-65°C間進(jìn)行，以減少一次升降溫過(guò)程，提高了反應(yīng)速度。1.1.2雙脫氫鏈終止法核酸模板在核酸聚合酶、引物、四種單脫氧堿基存在條件下復(fù)制或轉(zhuǎn)錄時(shí)，如果在四管反應(yīng)系統(tǒng)中分別按比例引入四種雙脫氧堿基，只要雙脫氧堿基摻入鏈端，該鏈就停止延長(zhǎng)，鏈端摻入單脫氧堿基的片段可繼續(xù)延長(zhǎng)。如此每管反應(yīng)體系中便合成以共同引物為5’端，以雙脫氧堿基為3’端的一系列長(zhǎng)度不等的核酸片段。反應(yīng)終止后，分四個(gè)泳道進(jìn)行電泳。以分離長(zhǎng)短不一的核酸片段（長(zhǎng)度相鄰者僅差一個(gè)堿基），根據(jù)片段3’端的雙脫氧堿基，便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序。主要步驟如下：Sanger雙脫氧鏈終止法（酶法）測(cè)序程序操作程序是按DNA復(fù)制和RNA反轉(zhuǎn)錄的原理設(shè)計(jì)的。分離待測(cè)核酸模板，模板可以是DNA，也可以是RNA，可以是雙鏈，也可以是單鏈。在4只試管中加入適當(dāng)?shù)囊?、模板?種dNTP（包括放射性標(biāo)記dATP，例如?32PdATP和DNA聚合酶（如以RNA為模板，則用反轉(zhuǎn)錄酶），再在上述4只管中分別加入一種一定濃度的ddNTP（雙脫氧核苷酸）。與單鏈模板（如以雙鏈作模板，要作變性處理）結(jié)合的引物，在DNA聚合酶作用下從5’端向3’端進(jìn)行延伸反應(yīng)，32P隨著引物延長(zhǎng)摻入到新合成鏈中。當(dāng)ddNTP摻入時(shí)，由于它在3’位置沒(méi)有羥基，故不與下一個(gè)dNTP結(jié)合，從而使鏈延伸終止。ddNTP在不同位置摻入，因而產(chǎn)生一系列不同長(zhǎng)度的新的DNA鏈。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳同時(shí)分離4只反應(yīng)管中的反應(yīng)產(chǎn)物，由于每一反應(yīng)管中只加一種ddNTP（如ddATP），則該管中各種長(zhǎng)度的DNA都終止于該種堿基（如A）處。所以凝膠電泳中該泳道不同帶的DNA3’末端都為同一種雙脫氧堿基。放射自顯影。根據(jù)四泳道的編號(hào)和每個(gè)泳道中DNA帶的位置直接從自顯影圖譜上讀出與模板鏈互補(bǔ)的新鏈序列。1.2基因工程制藥下游技術(shù)1.2.1基因工程菌的培養(yǎng)基因工程菌的培養(yǎng)過(guò)程主要包括：通過(guò)搖瓶操作了解工程菌生長(zhǎng)的基礎(chǔ)條件；通過(guò)培養(yǎng)罐操作確定培養(yǎng)參數(shù)和控制的方案以及順序。由于細(xì)胞生長(zhǎng)和異源基因表達(dá)之間有著較大的差異，各培養(yǎng)參數(shù)在全過(guò)程中必須分段控制。培養(yǎng)方式主要有：一、補(bǔ)料分批培養(yǎng)補(bǔ)料分批培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進(jìn)一步生長(zhǎng)的培養(yǎng)方法。二、連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中，攪拌培養(yǎng)至一定菌體濃度后，開(kāi)動(dòng)進(jìn)料和出料的蠕動(dòng)泵，以控制一定稀釋率進(jìn)行不間斷的培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)可為微生物提供恒定的生活環(huán)境，控制其比生長(zhǎng)速率。三、透析培養(yǎng)透析培養(yǎng)是利用膜的半透性原理使代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基分離，通過(guò)去除培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來(lái)解除其對(duì)生產(chǎn)菌的不利影響。采用膜透析裝置是在發(fā)酵過(guò)程中用蠕動(dòng)泵將發(fā)酵液打入罐外的膜透析器的一側(cè)循環(huán)，其另一側(cè)通入透析液循環(huán)。四、固定化培養(yǎng)基因工程菌經(jīng)固定化培養(yǎng)后，解決了質(zhì)粒的穩(wěn)定性問(wèn)題，該培養(yǎng)方式對(duì)分泌型菌更為有利1.2.2基因工程菌細(xì)胞的破碎現(xiàn)今，在基因工程菌的研究中，主要涉及有細(xì)菌，酵母和藻類(lèi)。微生物的細(xì)胞壁比較堅(jiān)韌。目前已發(fā)展了多種細(xì)胞破碎方法，以便適應(yīng)不同用途和不同類(lèi)型的細(xì)胞壁破碎。破碎方法可規(guī)納為機(jī)械法和非機(jī)械法兩大類(lèi)。機(jī)械法有很多類(lèi)型，常見(jiàn)的有：高壓勻漿破碎法(homogenization)，振湯珠擊破碎法(SkakingBead)，高速攪拌珠研磨破碎法(finegrinding)，超聲波破碎法(ultrasonication)0非機(jī)械法有如下類(lèi)型：滲透壓沖擊破碎法(osmoticshock)，凍融破碎法(freezingandthawing)，酶溶破碎法(enzymelysis)，化學(xué)破碎法(chemicaltreatment)，去垢劑破碎(detergents)。1.2.3基因工程蛋白的分離和純化基因重組產(chǎn)物均在其宿主細(xì)胞內(nèi)克隆表達(dá)，且大多為胞內(nèi)物質(zhì)?；蛑亟M蛋白的分離和純化，由于目標(biāo)產(chǎn)物的性質(zhì)和對(duì)產(chǎn)品純化要求不同，其分離和純化的方法和選擇的純化路徑也不同，但主要分為兩個(gè)方面：1.目標(biāo)產(chǎn)物的粗級(jí)分離，主要是在細(xì)胞培養(yǎng)后，將細(xì)胞從培養(yǎng)液中分離出來(lái)，然后再破碎細(xì)胞釋放產(chǎn)物，溶解包含體，復(fù)原蛋白質(zhì)以除去大部分雜質(zhì)；2.目標(biāo)產(chǎn)物的純化，這是在分離的基礎(chǔ)上，用各種具體高選擇性的精密儀器，使產(chǎn)物的純度和回收率。主要分離技術(shù)：離心及沉淀離心分離的原理是在轉(zhuǎn)子高速轉(zhuǎn)動(dòng)所產(chǎn)生的離心力的驅(qū)動(dòng)下，利用固體及液體間的密度差來(lái)進(jìn)行懸浮液，乳濁液的分離。沉淀原理是利用油和雜質(zhì)的不同密度，借助策略的作用，達(dá)到自然分離才者的一種方法。膜分離膜分離是在20世紀(jì)初出現(xiàn)，20世紀(jì)60年代后迅速崛起的一門(mén)分離新技術(shù)。膜分離技術(shù)由于兼有分離、濃縮、純化和精制的功能，又有高效、節(jié)能、環(huán)保、分子級(jí)過(guò)濾及過(guò)濾過(guò)程簡(jiǎn)單、易于控制等特征，因此，目前已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、生物、環(huán)保、化工、冶金、能源、石油、水處理、電子、仿生等領(lǐng)域，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，已成為當(dāng)今分離科學(xué)中最重要的手段之一。雙水相萃取某些親水性高分子聚合物的水溶液超過(guò)一定濃度后可以形成兩相，并且在兩相中水分均占很大比例，即形成雙水相系統(tǒng)。利用親水性高分子聚合物的水溶液可形成雙水相的性質(zhì)，Albertsson于20世紀(jì)50年代后期開(kāi)發(fā)了雙水相萃取法，又稱(chēng)雙水相分配法。20世紀(jì)70年代，科學(xué)家又發(fā)展了雙水相萃取在生物分離過(guò)程中的應(yīng)用，為蛋白質(zhì)特別是胞內(nèi)蛋白質(zhì)的分離和純化開(kāi)辟了新的途徑。反膠團(tuán)萃取蛋白質(zhì)溶解于小水池中(正萃，或稱(chēng)萃取)，其周?chē)幸粚铀ぜ氨砻婊钚詣O性頭的保護(hù)，使其避免與有機(jī)溶劑接觸而失活。改變pH、鹽濃度等條件蛋白質(zhì)又可回到水相(反萃)，實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的萃取分離、純化目的。反膠團(tuán)萃取蛋白質(zhì)的機(jī)理目前尚不十分清楚。一般認(rèn)為，萃取過(guò)程是靜電力、疏水力、空間力、親和力或幾種力協(xié)同作用的結(jié)果，其中蛋白質(zhì)與表面活性劑極性頭間的靜電相互作用是主要推動(dòng)力。根據(jù)所用表面活性劑類(lèi)型，通過(guò)控制水相pH高于或低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI)，達(dá)到正萃反萃的目的。2基因工程藥物應(yīng)用事例2.1胰島素胰島素是基因工程藥物最重要的代表。胰島素是由胰產(chǎn)生的一種蛋白。它在人體新陳代謝中起著重要作用，如果體內(nèi)不足就會(huì)引發(fā)糖尿病，因此胰島素是治療糖尿病的特效藥。這種病發(fā)病率很高，困擾著上千萬(wàn)人。過(guò)去從豬、牛胰中提取胰島素，產(chǎn)量低，滿(mǎn)足不了患者的需求?，F(xiàn)在利用基因工程技術(shù)，有兩種方法可以讓微生物發(fā)酵產(chǎn)生胰島素。一種是先在大腸桿菌中分別合成胰島素A鏈和B鏈，然后再在體外用化學(xué)方法將兩條鏈連接成胰島素。美國(guó)Elililly公司采用這種方法生產(chǎn)胰島素。另一種是采用分泌型載體表達(dá)胰島素原，然后再將其轉(zhuǎn)化為胰島素。丹麥NovoNordisk公司就是采用重組酵母分泌產(chǎn)生胰島素原，再用酶法轉(zhuǎn)化為人胰島素。2.2干擾素干擾素是病毒入侵人體或其他動(dòng)物后，機(jī)體產(chǎn)生的可以對(duì)多種病毒具有抵抗能力，抑制它們復(fù)制、增殖的一種蛋白質(zhì)。它是一類(lèi)在同種細(xì)胞上具有廣譜抗病毒活性的蛋白質(zhì)，其活性受細(xì)胞基因組的調(diào)控。在一般生理狀態(tài)下，細(xì)胞的干擾素基因呈靜止?fàn)顟B(tài)，只有在干擾素誘導(dǎo)劑作用下，干擾素基因才進(jìn)行轉(zhuǎn)錄并翻譯出具有種屬特異性的干擾素。干擾素本身不能直接殺滅活病毒，但是它能使細(xì)胞產(chǎn)生許多抗病毒蛋白質(zhì)，使病毒的mRNA不能和核酸體結(jié)合，因而無(wú)法合成病毒蛋白質(zhì)，從而減少了新病毒粒子的合成，阻斷了病毒的增殖。它在臨床上主要用于惡性腫瘤和病毒性疾病的治療。過(guò)去，干擾素一般只能從感染病毒的人血液中的白細(xì)胞或纖維中提取，量少價(jià)昂，難以應(yīng)用于臨床。1980年美國(guó)基因技術(shù)公司把人體血細(xì)胞干擾素基因轉(zhuǎn)移到大腸桿菌或酵母菌中，成功表達(dá)。其中a、0、r種干擾素已工業(yè)化生產(chǎn)，產(chǎn)品已投放市場(chǎng)。我國(guó)也已生產(chǎn)出a型和r型干擾素。2.3重組疫苗所謂重組疫苗就是利用重組DNA技術(shù)，克隆并表達(dá)抗原基因的編碼序列，并將表達(dá)產(chǎn)物用作疫苗。重組疫苗的重要性在于它可以替代滅活或無(wú)感染力的病原微生物來(lái)進(jìn)行免疫。第一個(gè)應(yīng)用于人體的重組疫苗是用酵母菌生產(chǎn)的乙肝疫苗。它是將乙肝表面蛋白抗原基因在酵母菌中克隆和表達(dá)，生產(chǎn)出來(lái)的蛋白及其聚合物與在感染體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的十分相似，將這些聚合物純化，制成乙肝疫苗，可以用于使人體產(chǎn)生對(duì)乙肝病毒的免疫力。在生物技術(shù)總的發(fā)展趨勢(shì)下，基因工程制藥仍是21世紀(jì)生物制藥中最具活力的研究領(lǐng)域.隨著人類(lèi)基因組中更多基因的功能被研究清楚和藥物基因組學(xué)的不斷完善，將可能有數(shù)以千計(jì)的具有特殊療效的蛋白質(zhì)藥物問(wèn)世。這將使傳統(tǒng)的醫(yī)藥業(yè)發(fā)生革命性變化。藥物的生產(chǎn)和使用將會(huì)更加趨于種族化、家族化甚至個(gè)體化。5參考文獻(xiàn)青島海博生物技