基因工程實(shí)習(xí)指導(dǎo)書(shū)適用專(zhuān)業(yè):生物技術(shù) 周數(shù)：2周學(xué)分：2編寫(xiě)人：陳英審定人：1實(shí)習(xí)目的植物遺傳轉(zhuǎn)化(genetictransformation)是指將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞，獲得轉(zhuǎn)基因植物的技術(shù)。自1983年第一株轉(zhuǎn)基因煙草問(wèn)世以來(lái)，二十多年來(lái)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已得到長(zhǎng)足的發(fā)展。植物遺傳轉(zhuǎn)化方法是植物遺傳轉(zhuǎn)化的重要環(huán)節(jié)，迄今為止已建立了多種植物遺傳轉(zhuǎn)化體系和轉(zhuǎn)基因技術(shù)。歸納起來(lái)，包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、PEG法、電擊法、顯微注射法等，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是目前雙子葉植物轉(zhuǎn)基因最常用的方法。通過(guò)本實(shí)習(xí)，學(xué)生進(jìn)一步學(xué)習(xí)植物遺傳轉(zhuǎn)化的基本原理，了解植物遺傳轉(zhuǎn)化與檢測(cè)的流程，掌握多種以根癌農(nóng)桿菌位介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法和技術(shù)。2實(shí)習(xí)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)一擬南芥花序浸潤(rùn)轉(zhuǎn)化擬南芥是自花授粉植物，具有高度純合、植株小、生長(zhǎng)周期短(從發(fā)芽到開(kāi)花不超過(guò)6周)、結(jié)籽多和生活能力強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。用理化因素處理突變率很高，容易獲得各種代謝功能的缺陷型。所以擬南芥是進(jìn)行遺傳學(xué)研究的極好材料，被科學(xué)家譽(yù)為“植物中的果蠅”。一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)本實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步學(xué)習(xí)農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物遺傳轉(zhuǎn)化的基本原理，掌握擬南芥花序浸潤(rùn)法遺傳轉(zhuǎn)化的流程。二、 實(shí)驗(yàn)原理農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化利用的是一種能夠?qū)崿F(xiàn)DNA轉(zhuǎn)移和整合的天然系統(tǒng)，即根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒和發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒。Ti質(zhì)粒經(jīng)過(guò)改造，使之帶有T-DNA的左右邊界序列，左右邊界序列間是多克隆位點(diǎn)，便于目的基因的插入。將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，然后再轉(zhuǎn)入植物，目的基因通過(guò)T-DNA序列與植物受體細(xì)胞染色體DNA同源序列進(jìn)行同源重組而整合。通過(guò)選擇標(biāo)記篩選及分子檢測(cè)，既可獲得轉(zhuǎn)基因植株。三、實(shí)驗(yàn)材料擬南芥四、儀器設(shè)備1） 剪刀、培養(yǎng)皿、三角燒瓶（高壓滅菌，烘干）2） 50ml離心管、2ml離心管、1ml槍頭、200卩1槍頭（高壓滅菌，烘干）3） 超凈工作臺(tái)、搖床、離心機(jī)。五、實(shí)驗(yàn)步驟擬南芥種植：把種子懸浮在0.05%瓊脂糖中，黑暗中，4°C,放置3天，打破休眠。這一步可以使得種子萌發(fā)一致，并且提高萌發(fā)率。每一個(gè)培養(yǎng)盆中放置4-5個(gè)種子。如果有條件在短日照條件下生長(zhǎng)3-4周（8小時(shí)光照，16小時(shí)黑暗），然后將他們轉(zhuǎn)移到長(zhǎng)日照下誘導(dǎo)開(kāi)花。播種的前兩周加蓋保鮮膜保持高濕度。當(dāng)擬南芥花序生長(zhǎng)到2-3厘米，剪掉花序的頭部，可以使得更多的花絮沖蓮座葉的基部生長(zhǎng)，在這之后6-8天可以進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化之前移除已經(jīng)產(chǎn)生的長(zhǎng)角果，可以增加轉(zhuǎn)化效率，并且減少首次篩選時(shí)的污染情況。準(zhǔn)備含有要轉(zhuǎn)化基因的農(nóng)桿菌EHA105（pBI121）,從stock中劃平板，挑取單克隆，在5-ml液體LB培養(yǎng)基中（含有50mg/LKm和50mg/LStr），28C生長(zhǎng)24小時(shí)。1:100或1:200擴(kuò)大培養(yǎng)，40mlLB（含有兩種抗生素）。28C生長(zhǎng)16-24小時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)到靜止?fàn)顟B(tài)（0D600=1.5-2.0）。4000g室溫離心10min，收集菌體，使用40ml新鮮配制的5%（wt/vol）蔗糖溶液重懸菌體。離心和重懸在50ml管中完成。在上述溶液中加入8卩1SilwetL-77（0.02%（vol/vol）），立即混勻，可以進(jìn)行下一步dip。每一個(gè)花序浸泡1min,不要忽略生長(zhǎng)在蓮座葉基部的花序，浸泡完的植株側(cè)倒放置在托盤(pán)中，然后使用保鮮膜包裹托盤(pán)。黑暗，室溫，保持濕度放置24小時(shí)。去掉保鮮膜，將擬南芥放回培養(yǎng)箱，正常生長(zhǎng)1個(gè)月，此間需要水分較多，不要忘記澆水。之后停止?jié)菜?，等待長(zhǎng)角果成熟。使用篩子收集種子，最好使用濾紙包裹種子而不是管子存放種子(很難取出)。4°C在培養(yǎng)皿中存放。六、溶液配制LB培養(yǎng)基1LNaCL10gPeptone10gYeastextract5g實(shí)驗(yàn)二使用潮霉素B對(duì)擬南芥T1代種子進(jìn)行篩選植物遺傳轉(zhuǎn)化的目的就是將外源基因整合到受體樹(shù)種的基因組中并使之有效地表達(dá)，因此涉及的基因有兩類(lèi)：一類(lèi)被稱(chēng)作為報(bào)告基因(reportergene)或稱(chēng)為標(biāo)記基因(markergene),另一類(lèi)就是有一定經(jīng)濟(jì)價(jià)植的目的基因。選擇標(biāo)記的功能是在選擇壓力下把轉(zhuǎn)化體選擇出來(lái)。為了這個(gè)目的，要在培養(yǎng)基中加入選擇劑，產(chǎn)生選擇壓力，導(dǎo)致未轉(zhuǎn)化細(xì)胞不能生長(zhǎng)，發(fā)育。含有標(biāo)記基因的細(xì)胞，對(duì)選擇劑具有抗性，能夠正常生長(zhǎng)。常用的標(biāo)記基因：新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(NPTII)——卡那霉素;潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(HPT)——潮霉素；抗除草劑基因(Bar)——雙丙氨磷。一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)利用標(biāo)記基因篩選轉(zhuǎn)化體的原理和技術(shù)，掌握篩選轉(zhuǎn)化體的流程與技術(shù)。二、 實(shí)驗(yàn)原理將所收獲的T0代植株采用floral-dip進(jìn)行轉(zhuǎn)化后的T1代種子播種于含有相應(yīng)抗生素(視載體中的篩選標(biāo)記基因而定)的培養(yǎng)基上，進(jìn)行萌發(fā)。轉(zhuǎn)化體由于已轉(zhuǎn)入了篩選標(biāo)記基因，并得以表達(dá)，從而解除了該抗生素對(duì)植物體產(chǎn)生的脅迫，植株可正常生長(zhǎng)，而非轉(zhuǎn)化體卻因選擇壓力而逐漸死亡。三、實(shí)驗(yàn)材料擬南芥T1代種子四、儀器設(shè)備1）培養(yǎng)皿、三角燒瓶（高壓滅菌，烘干）2） 10ml離心管、2ml離心管、1ml槍頭、200卩1槍頭（高壓滅菌，烘干）3） 超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、離心機(jī)。五、實(shí)驗(yàn)步驟T0代植株采用floral-dip進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，收取T1代種子。將T1代種子放入1.5mLEP管中，約放入到管底接合部1/2處（約需要9cm培養(yǎng)皿2個(gè)），使用Milli-Q清洗種子，在4°C中放置3天。加入70%乙醇1ml,混勻30s靜置15s，用槍將乙醇吸去加入1mL0.1%HgCl2+0.1%TritonX-100渦旋3min靜置15s，用槍吸去上清使用滅菌水，清洗4次，每次靜置，吸走上清加入滅過(guò)菌的0.05%agarose（瓊脂糖）3mL，渦旋，使種子重懸，使用剪頭的藍(lán)槍頭，將種子分別打到含有或不含有抗生素的BasicAgarmedium平板上，晃動(dòng)平板，使種子盡量分散。Parafilm封好培養(yǎng)皿，在光照培養(yǎng)箱中16h光照培養(yǎng)，10d觀察結(jié)果，陽(yáng)性T1代seedlings應(yīng)該明顯比非轉(zhuǎn)化植株大。六、溶液配制BasicAgarmedium平板KN031g溶解到10mL去離子水中，1.5mL管分裝，-20C保存100mL去離子水，加入瓊脂粉0.8g，KNO3溶液100此，pH自然，高壓滅菌微波爐中融化，加入Hygromycin20mg/L，cefotaxime100mg/L，倒平板。實(shí)驗(yàn)三gus基因在煙草中的瞬時(shí)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物的分子檢測(cè)是鑒定轉(zhuǎn)基因植物的重要手段。目前轉(zhuǎn)基因植物的鑒定方法有很多種要根據(jù)不同的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和轉(zhuǎn)化技術(shù)，選擇合適的檢測(cè)方法，通常采用PCR技術(shù)、Southern雜交，Northern雜交，GUS與BAR生化檢測(cè)，蛋白質(zhì)分析技術(shù)等方法。報(bào)告基因是一種編碼可被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說(shuō)，是一個(gè)其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。其作用主要是提供基因調(diào)節(jié)和基因行為的遺傳信息，在基因調(diào)控系統(tǒng)中起著選擇標(biāo)記（selectionmarker）和報(bào)告基因調(diào)控信息的雙重作用。用于快速檢測(cè)是否轉(zhuǎn)化成功，分析轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)調(diào)控以及分析轉(zhuǎn)化方法的效率。在植物基因工程研究領(lǐng)域中，常使用的報(bào)告基因主要有：0-葡萄糖苷酸酶基因（gus）,熒光素酶的基因（luc），綠色熒光蛋白基因（gfp）。Gus基因是目前轉(zhuǎn)基因植物中應(yīng)用非常廣泛的報(bào)告基因。Gus基因在轉(zhuǎn)基因植物中的活性檢測(cè)方法有化學(xué)組織定位法、分光光度法、熒光分析法等。一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆绽酶┺r(nóng)桿菌進(jìn)行煙草遺傳轉(zhuǎn)化的原理和方法。學(xué)習(xí)利用報(bào)告基因檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株的原理和方法。掌握利用化學(xué)組織定位法檢測(cè)gus基因在轉(zhuǎn)基因植物中的瞬間表達(dá)的原理和方法。二、 實(shí)驗(yàn)原理gus基因存在于E.coli等一些細(xì)菌基因組內(nèi)，編碼卩-葡萄糖苷酸酶。卩-葡萄糖苷酸酶是一個(gè)水解酶，以卩-葡萄糖苷酸酯類(lèi)物質(zhì)為底物，其反應(yīng)產(chǎn)物可用多種方法檢測(cè)出來(lái)。組織化學(xué)法檢測(cè)以5-溴-4-氯-3-吲哚-卩-葡萄糖苷酸酯（X-Gluc）作為反應(yīng)底物。將被檢材料用含有底物的緩沖液浸泡，若組織細(xì)胞發(fā)生了解gus基因的轉(zhuǎn)化，并表達(dá)出Gus，在適宜的條件下，該酶就可將X-Gluc水解生成藍(lán)色產(chǎn)物，用肉眼或在顯微鏡下可看到，且在一定程度下根據(jù)染色深淺可反映出Gus活性。三、 實(shí)驗(yàn)材料煙草四、 儀器設(shè)備1） 培養(yǎng)皿、三角燒瓶（高壓滅菌，烘干）2）注射器，2ml離心管、1ml槍頭、200卩1槍頭（高壓滅菌，烘干）3） 超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、離心機(jī)。五、實(shí)驗(yàn)步驟1.挑取單菌落GV3101（35gs-gus）于5mlYEB中，200rpm,28°C，培養(yǎng)24小時(shí)；2.1000rpm，室溫離心10min；

去上清，加5ml滲透培養(yǎng)基重懸，200rpm,28°C，培養(yǎng)2-3小時(shí)；lOOOrpm，室溫離心lOmin,去上清，加5ml滲透培養(yǎng)基重懸，以徹底去除殘存的抗生素；5?測(cè)定OD6OO，按照所測(cè)定的OD值用滲透培養(yǎng)基稀釋至OD0.5；6OO將植物從培養(yǎng)箱中移出，至于白熒光燈小l小時(shí)，使氣孔完全張開(kāi)，便于滲透；選擇合適的葉片，在葉背面用去掉針頭的針管摩擦出一個(gè)小口，去除角質(zhì)層，利于轉(zhuǎn)化時(shí)降低滲透壓，減少對(duì)細(xì)胞的損害；將滲透液吸入lml針管中，將針管頭部壓下葉片下表面，用指頭支持在上表面，輕壓活塞，能看到液體在葉肉細(xì)胞間隙中擴(kuò)散；滲透后，使用記號(hào)筆勾畫(huà)出滲透區(qū)域(2-3cm2)；10?菌液也按步驟8-9進(jìn)行；11.放入培養(yǎng)箱，培養(yǎng)3-4天；12?將轉(zhuǎn)化部位用剪刀剪下，浸入固定液，室溫下輕搖30-60分鐘；取出材料，用磷酸鈉緩沖液漂洗3-4次；加入染色液，浸沒(méi)材料，蓋上管蓋，37C保溫過(guò)夜。取出材料，放入FAA固定液中20分鐘；先后用20%和50%乙醇浸泡20分鐘，100%乙醇浸泡過(guò)夜肉眼或在顯微鏡下觀察Gus表達(dá)位點(diǎn)。六、溶液配制1．滲透培養(yǎng)基：50mlD-葡萄糖250mgMES儲(chǔ)液500mM5mlNa3PO4?12H2O(20mM)乙酰丁香酮1M5ml5“l(fā)2.50mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH7.0)：A液：稱(chēng)取NaH2PO4?2H2O3.12g溶于100ml無(wú)菌蒸餾水B液：稱(chēng)取Na2HPO4?12H2O7.17g溶于100ml無(wú)菌蒸餾水取39mlA液和61mlB液混合。3．染色液：[50mMNa2HPO4buffer(PH7.0),10MmEDTA,0.01%Tween-80,and0.5mg/mlX-gluc.]2mL0.5MEDTA10uL100%Tween-801mL50mg/mLX-gluc97ml50mMNa2HPO4buffer(PH7.0)一般固定液：5ml甲醛，5ml乙酸，70%乙醇90ml.FAA固定脫色液：5%甲醛，5%乙酸，5%乙醇。實(shí)驗(yàn)四植株組織總DNA的分離DNA是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，大多數(shù)基因組分析、利用遺傳標(biāo)記進(jìn)行作圖研究以及基因工程均需分離植物核酸。因此DNA的提取被視為基因工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)中最重要、最基本的操作。在基因工程研究中，獲得高質(zhì)量的基因組是獲得目的教育、教學(xué)基因克隆、目的基因遺傳轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)基因植物的分子檢測(cè)等后續(xù)工作的前提和保證。高質(zhì)量DNA應(yīng)該滿(mǎn)足如下要求：1）結(jié)構(gòu)完整；2）無(wú)其它大分子成分的污染（蛋白質(zhì)、多糖及RNA等）；3）提取樣品中不含對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑及高濃度的金屬離子。一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆绽肅TAB（Cetyltrimethylammonium-dromide，十六烷基三甲基溴化銨）法分離植物總DNA的原理和技術(shù)。提取已獲得的卡那抗性植株總DNA，以便進(jìn)行分子檢測(cè)oCTAB方法的特點(diǎn)是制備的DNA純度高、結(jié)構(gòu)完整，適用于PCR擴(kuò)增檢測(cè)，基因分離和Southern雜交等。二、 實(shí)驗(yàn)原理植物組織經(jīng)液氮速凍，充分研磨，溶于CTAB裂解液，加熱至65°C,使大部分蛋白質(zhì)變性。氯仿：異戊醇2次抽提可去除變性的蛋白質(zhì)和大部分碳水化合物。高鹽時(shí)，DNA溶于水相。加入2倍體積的乙醇，鹽濃度降低，DNA與CTAB形成不溶的復(fù)合物并沉淀出來(lái)，從而達(dá)到分離植物DNA的目的。三、 實(shí)驗(yàn)材料煙草四、儀器設(shè)備研缽、研杵、剪刀、鑷子(用洗滌劑清潔，高壓滅菌并烘干；(-20°C放置)10ml樣品管、2ml離心管、1ml槍頭、200卩1槍頭(高壓滅菌，烘干)水浴鍋、渦旋儀、離心機(jī)、移液槍。五、實(shí)驗(yàn)步驟取600ulCTAB+2%巰基乙醇裂解液，于1.5mlEppendorf管中，65C水浴中預(yù)熱；取0.1-0.2g新鮮植物葉片于研缽中，加液氮速凍、研磨2-3次至細(xì)粉末；用小匙將細(xì)粉末轉(zhuǎn)至已預(yù)熱的裂解液中，充分混勻后，于65C水浴中保溫30min,期間可輕輕搖動(dòng)數(shù)次，使離心管內(nèi)溫度達(dá)到60C左右；將混合物降至室溫。加入600ul氯仿:異戊醇(24：1),充分混勻后,室溫下12000rpm離心10min，上清液移至另一Eppendorf管中。取500ul上清液于一Eppendorf中，加入等體積的氯仿：異戊醇(24：1)再抽提一次，充分混勻后，室溫下12000rpm離心10min，上清液移至另一Eppendorf管中。⑹向Eppendorf管中加入2倍體積的無(wú)水乙醇，輕輕混