第十一章細菌第1頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三細菌的分類試驗臺操作操作規(guī)則獲得細菌的途徑細菌培養(yǎng)和維護獲得分離的克隆細菌計數(shù)貯藏污染第2頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三一細菌的分類

1級（不致?。┐竽c桿菌枯草桿菌2級（低致?。┥抽T氏菌志賀氏菌BL1&BL2級操作3級（高治病）結(jié)核分支桿菌牛分支桿菌BL3級操作4級（對個體和社會造成巨大危害）部分節(jié)肢動物傳染病毒、沙粒病毒和線狀病毒

BL4級操作第3頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三細菌的分類試驗臺操作操作規(guī)則獲得細菌的途徑細菌培養(yǎng)和維護獲得分離的克隆細菌計數(shù)貯藏污染第4頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三二試驗臺操作篩選突變體培養(yǎng)有機體測定細菌的濃度離心培養(yǎng)物轉(zhuǎn)化抽提質(zhì)粒培養(yǎng)使用過的廢物分：鋒利的、液體廢物、固體廢物、放射性廢物等第5頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三細菌的分類試驗臺操作操作規(guī)則獲得細菌的途徑細菌培養(yǎng)和維護獲得分離的克隆細菌計數(shù)貯藏污染第6頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三三操作規(guī)則遵守最通常的實驗室安全守則每天最少清洗一次試驗臺丟棄可能傳染疾病的廢物前要清除污染接觸可傳染的物質(zhì)后，在離開實驗室前都要洗手實驗中盡量避免產(chǎn)生氣溶膠不要積累培養(yǎng)皿和試管第7頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三廢物處理液體廢物：加入次氯酸鈉至終濃度10%，放置30分鐘后再倒入下水道，大量水沖洗。固體廢物：當作有生物危害的物品處理，高溫高壓滅菌后丟棄，這是一個實驗室或是系的責(zé)任而且必須注明。第8頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三細菌的分類試驗臺操作操作規(guī)則獲得細菌的途徑細菌培養(yǎng)和維護獲得分離的克隆細菌計數(shù)貯藏污染第9頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三四獲得細菌的途徑實驗室成員其他研究人員美國模式培養(yǎng)物保藏所（ATCC）其他的收集和服務(wù)組織(疾病控制和防治中心等)每得到新菌株都要確認它的確是你所需要的那種，不要根據(jù)包裝或價格來認定第10頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三培養(yǎng)細菌的價值細菌的分類試驗臺操作操作規(guī)則獲得細菌的途徑細菌培養(yǎng)和維護獲得分離的克隆細菌計數(shù)貯藏污染第11頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三五細菌培養(yǎng)和維護搖瓶培養(yǎng)和固定培養(yǎng)液體培養(yǎng)、半固體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)2細菌培養(yǎng)的方法1了解所培養(yǎng)微生物的生理知識第12頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三

大腸桿菌在液體培養(yǎng)基中的正常生長曲線滯后期穩(wěn)定期對數(shù)期死亡期第13頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三3培養(yǎng)基的分類

按用途分類基礎(chǔ)培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)基按物理性狀分類液體培養(yǎng)基：不含凝固劑，用于增菌和接種純種細菌。半固體培養(yǎng)基：含0.3％～0.5％瓊脂。用于觀察細菌動力、保存菌種。固體培養(yǎng)基：平板、斜面。含2％～2.5％瓊脂。平板：用于細菌的分離培養(yǎng)。斜面：用于純培養(yǎng)、保存菌種。第14頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三4培養(yǎng)基制備的一般程序調(diào)配溶化矯正pH過濾澄清分裝滅菌檢定保存第15頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三4培養(yǎng)基制備的一般程序調(diào)配：按照培養(yǎng)基配方正確稱取各種原料放于搪瓷杯中。另用量筒量取所需蒸餾水量。溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒攪勻，加熱溶解。加瓊脂溶化：加熱過程中要不斷攪拌，可適當補水。調(diào)pH值：用1NNaOH或1NHCl調(diào)至培養(yǎng)基規(guī)定的pH值，用pH試紙對照。分裝加塞：注意不要污染棉塞。塞好棉塞的試管和錐形瓶應(yīng)蓋上厚紙用繩捆札，準備滅菌。滅菌：不同培養(yǎng)基采取不同滅菌方法。檢定：培養(yǎng)基滅菌后必須在37℃下恒溫培養(yǎng)24h，確定無菌生長，方可使用。保存：一般至4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

第16頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三復(fù)蘇培養(yǎng)復(fù)蘇凍干菌復(fù)蘇凍存菌株復(fù)蘇復(fù)雜營養(yǎng)細菌培養(yǎng)物第17頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三復(fù)蘇凍干菌的步驟

用70%的乙醇清潔管子的外部加入0.4ml的無菌培養(yǎng)基（預(yù)熱的）至試管中用吸管小心吹打，直到菌體完全懸浮將懸浮液加到含5ml培養(yǎng)基（預(yù)熱的）的試管中，留下10ul將剩下的10ul菌液劃線培養(yǎng)在合適條件下培養(yǎng)試管、平板或斜面第18頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三復(fù)蘇培養(yǎng)復(fù)蘇凍干菌復(fù)蘇凍存菌株復(fù)蘇復(fù)雜營養(yǎng)細菌培養(yǎng)物第19頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三復(fù)蘇凍存菌株的步驟

將凍存管拿出后立即放到實驗臺或通風(fēng)櫥火焰灼燒接種環(huán)，冷卻幾秒后，接觸凍存培養(yǎng)基的頂部把培養(yǎng)物放回冰上在平板或斜面上劃線凍存管立即放回冰箱，至少-70度在適當?shù)臈l件下培養(yǎng)平板或斜面第20頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三復(fù)蘇培養(yǎng)復(fù)蘇凍干菌復(fù)蘇凍存菌株復(fù)蘇復(fù)雜營養(yǎng)細菌培養(yǎng)物第21頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三復(fù)蘇復(fù)雜營養(yǎng)細菌培養(yǎng)物的步驟

將凍存管拿出37攝氏度溶解菌體使用巴氏管轉(zhuǎn)移約1/2體積菌液至4ml新鮮培養(yǎng)基中，把剩下的菌液放到冰上適當條件下培養(yǎng)凍存管立即放回冰箱，至少-70度第22頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三培養(yǎng)細菌的價值細菌的分類試驗臺操作操作規(guī)則獲得細菌的途徑細菌培養(yǎng)和維護獲得分離的克隆細菌計數(shù)貯藏污染第23頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三獲得分離的克隆平板劃線在平板底面上標好你的名字、日期和菌株。加熱接種環(huán)。左手拿試管，振蕩懸浮菌體，用右手的最后兩個手指打開試管蓋子，將試管口在火焰上燒一下。插入接種環(huán)（已經(jīng)冷卻），不要接觸試管壁，插入液體表面即可。再一次將試管口在火焰上燒一下，蓋好蓋子放回試管架。動作要快，但是不要舞動接種環(huán)。左手拿平板，用最后的三個指頭托住底面，用大拇指和食指微微掀起蓋子。第24頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三7.在第一區(qū)靠近邊緣的地方把接種環(huán)接觸到培養(yǎng)基表面，不

要把接種環(huán)插到培養(yǎng)基里面。在這一區(qū)內(nèi)有節(jié)奏地前后移動接種環(huán)，直到運動到中央，不要跨線。8.蓋好平板的蓋子，從前到后再次灼燒接種環(huán)5-10s。9.90°旋轉(zhuǎn)平板，打開蓋子，接觸到第一區(qū)中間線末端處。從上一條線處劃過并進入空區(qū)，再在這一區(qū)內(nèi)繼續(xù)劃線，注意不要過線。10.在空白區(qū)域內(nèi)重復(fù)步驟8、9操作兩次。11.再次灼燒接種環(huán)，把它放好。12.在適當溫度下，倒置培養(yǎng)。第25頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三第26頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三第27頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三在一塊平板上劃線培養(yǎng)多個樣品斜面和穿刺培養(yǎng)使用接種針、牙簽或Tip挑取克隆。第28頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三第29頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三培養(yǎng)細菌的價值細菌的分類試驗臺操作操作規(guī)則獲得細菌的途徑細菌培養(yǎng)和維護獲得分離的克隆細菌計數(shù)貯藏污染第30頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三細菌計數(shù)使用PetroffHausser計數(shù)計活菌平板計數(shù)第31頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三使用PetroffHausser計數(shù)計用1ml或2ml的移液管無菌移取0.5ml的菌液至微量離心管中，如果菌液量較少，就減少移取的體積。取出計數(shù)計，用水和70%的乙醇將其清洗干凈，用吸水紙吸干，將蓋玻片放上，保證計數(shù)室處在蓋玻片的中央。將50μl菌液加入計數(shù)室。取樣前將菌體搖勻，吸出50μl，不要直接打下。緩慢按下移液器的按鈕，使液體滴出，但不要滴下，讓這一滴液體留在嘴尖，把這一滴液體接觸蓋玻片。第32頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三

的一邊，由于毛細現(xiàn)象液體會被吸入。注意不要使液體溢出計數(shù)室，如果液體溢出到溝槽內(nèi)，那么把板吸干重新來過。靜置5min。把計數(shù)板放在載物臺上，用10×物鏡找到計數(shù)室后，換到40×物鏡。大體數(shù)一下以決定是否需要稀釋，在25個小方塊內(nèi)應(yīng)有100-500個菌體。如果太多，計數(shù)會不準確。稀釋5或10倍后，半數(shù)時會省下很多時間。第33頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三計數(shù)。最少要計數(shù)25個方格內(nèi)的菌體數(shù)（包括壓線的），將數(shù)出的總數(shù)除以方格數(shù)，重復(fù)3次取平均值。計算。將平均每格內(nèi)的細胞數(shù)乘以2×107，如果進行稀釋了，再乘上稀釋倍數(shù)，得到的是原始菌液的細胞數(shù)/ml。第34頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三第35頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三第36頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三活菌平板計數(shù)制作稀釋液準備好稀釋用的試管，最常用的是10倍稀釋。900μl的培養(yǎng)基逐個進行稀釋、混合和移液。如果不清楚細菌生長的特點可以多準備8-10個平板。取100μl菌液至1號稀釋管中（10-1稀釋），棄掉移液管，將試管貼在振蕩器上混勻。從1號管中取100μl液體至2號稀釋管（10-2稀釋）棄掉移液管，把試管貼在振蕩器上混勻。依次轉(zhuǎn)移100μl至一系列的稀釋管中。第37頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三涂布平板在平板上標明稀釋度、姓名、日期和樣品名，最好能再做一個相同的備用板。從最后稀釋度的試管中取出100μl，慢慢滴入對應(yīng)的平板內(nèi)，棄掉移液管。將平板放到旋轉(zhuǎn)臺或?qū)嶒炁_上。將涂布棒在酒精內(nèi)浸一下，酒精必須覆蓋頭部和把手底部的1英寸處。第38頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三將涂布棒在火上灼燒，火焰應(yīng)該把涂布棒的前端全部燒遍，但是要反棒上的火焰立刻弄滅。將涂布棒放在培養(yǎng)基上直到冷卻，注意不要接觸到菌液。前后刮動涂布棒，爭取把液體覆蓋到整個平板上。如果有旋轉(zhuǎn)臺，把涂布棒固定，旋轉(zhuǎn)臺面進行涂布。待平板靜置5分鐘后再倒置放入培養(yǎng)箱，當菌落都能看清時，立即從培養(yǎng)箱中取出，不要讓菌落生長得過大。第39頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三計數(shù)菌落數(shù)和計算集落形成單位檢查所有的平板，挑出一個菌落數(shù)最接近30-300以內(nèi)的平板，只數(shù)一塊板，如果你做了備用板，那么就數(shù)兩塊。數(shù)出菌落數(shù)。菌落數(shù)乘以稀釋度倍數(shù)就得到原始菌液的濃度。第40頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三培養(yǎng)細菌的價值細菌的分類試驗臺操作操作規(guī)則獲得細菌的途徑細菌培養(yǎng)和維護獲得分離的克隆細菌計數(shù)貯藏污染第41頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三貯藏短期貯藏

4℃幾個星期，尤其平板。封口膜長期貯藏傳代培養(yǎng)（不推薦）優(yōu)點：能夠快速得到菌體，便宜缺點：活力降低，污染的可能性增加，表型的穩(wěn)定性下降。2.干燥常用于真菌和某些細菌，可保存數(shù)年優(yōu)點：便宜，不可能被污染。缺點：關(guān)于使用這種方法的菌株資料很難得到。第42頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三3.凍干可保存10年甚至50年。優(yōu)點：很容易做到長期保存。缺點：不是所有的實驗室都擁有相關(guān)的設(shè)備，而且對于經(jīng)常使

用的菌株也不方便，還有些菌株會喪失大量活力。4.低溫冰箱中冷凍和保存優(yōu)點：絕大多數(shù)細胞能夠很好地保存，是推薦使用的長期保存方法。缺點：冰箱價格昂貴，維護費也很高，凍融的時候會對細胞產(chǎn)生傷害。第43頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三培養(yǎng)細菌的價值細菌的分類試驗臺操作操作規(guī)則獲得細菌的途徑細菌培養(yǎng)和維護獲得分離的克隆細菌計數(shù)貯藏污染第44頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三污染平板每次使用平板前