?通過改變?nèi)芤簵l件，使溶質(zhì)以固體形式從溶液中分出的操作技術(shù)。?鹽析法?有機溶劑沉淀法?等電點沉淀法?結(jié)晶法目前一頁\總數(shù)五十七頁\編于八點第一節(jié)鹽析法(saltprecipitation)定義：鹽析法是利用各種生物分子在濃鹽溶液中溶解度的差異，通過向溶液中引入一定數(shù)量的中性鹽，使目的物或雜蛋白以沉淀析出，達(dá)到純化目的的方法。優(yōu)點：簡單、經(jīng)濟(jì)、較少變性缺點：分辨率不高，要除鹽目前二頁\總數(shù)五十七頁\編于八點兩種現(xiàn)象：鹽溶：低鹽情況，鹽離子強度的增高，蛋白質(zhì)溶解度增大鹽析：高鹽，鹽離子強度增加，蛋白質(zhì)溶解度減小目前三頁\總數(shù)五十七頁\編于八點一、基本原理目前四頁\總數(shù)五十七頁\編于八點原理?形成離子對，部分中和了蛋白質(zhì)的電性，排斥作用減弱而能相互靠攏，聚集起來。?中性鹽的親水性比蛋白質(zhì)大，使蛋白質(zhì)脫去了水化膜，使其沉淀。目前五頁\總數(shù)五十七頁\編于八點在鹽析區(qū)，符合公式logS=β-KsμS——蛋白質(zhì)溶解度，g/L；μ—鹽離子強度,Ci——i離子濃度，mol/L；Zi——i離子化合價；β——常數(shù),為縱坐標(biāo)上的截距;Ks——鹽析常數(shù)。目前六頁\總數(shù)五十七頁\編于八點β、KS?β為縱坐標(biāo)上的截距，是外推截距，與無機鹽種類無關(guān)。?KS是鹽析常數(shù)，與蛋白質(zhì)和鹽的種類有關(guān)，但與溫度和pH無關(guān)。?兩種類型：（1）在一定的pH和溫度下改變離子強度（鹽濃度）進(jìn)行鹽析，稱作KS鹽析法。（2）在一定離子強度下僅改變pH和溫度進(jìn)行鹽析，稱作β鹽析法。目前七頁\總數(shù)五十七頁\編于八點二、影響鹽析的因素（一）、無機鹽的種類鹽析能力：半徑小的高價離子在鹽析時的作用較強，陰離子的鹽析效果比陽離子好，尤其以高價陰離子更為明顯。PO43-＞SO42―＞CH3COO―＞Cl―＞NO3―＞I―NH4+＞K+＞Na+＞Li+鹽析用鹽要考慮幾個因素：常用硫酸銨目前八頁\總數(shù)五十七頁\編于八點(二）溶質(zhì)（蛋白質(zhì)等）種類的影響目前九頁\總數(shù)五十七頁\編于八點鹽析分布曲線目前十頁\總數(shù)五十七頁\編于八點（三）蛋白質(zhì)濃度的影響?蛋白質(zhì)濃度提高，鹽用量減少目前十一頁\總數(shù)五十七頁\編于八點（四）溫度的影響?溫度的變化會影響β值。?在無鹽或稀鹽溶液中，大多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度是隨溫度升高而增大的，但在高鹽溶液中常相反。目前十二頁\總數(shù)五十七頁\編于八點（五）pH的影響?當(dāng)溶液的pH在蛋白質(zhì)等電點附近時，β值最小。?利用β值最低點時pH的不同，可以分級沉淀蛋白質(zhì).目前十三頁\總數(shù)五十七頁\編于八點三、鹽析操作（一）鹽析用鹽的濃度表示固體粉末硫酸銨飽和溶液常用“飽和度”來表征硫酸銨在溶液中的最終濃度，25℃時(NH4)2SO4的飽和濃度為4.1mol／L，定義它為100%飽和度.目前十四頁\總數(shù)五十七頁\編于八點目前十五頁\總數(shù)五十七頁\編于八點（二）鹽析方法和注意事項1、分部鹽析法2、重復(fù)鹽析法3、反抽提法一定的鹽濃度下將目的蛋白夾帶一定量的雜蛋白一同沉淀。將沉淀用較低濃度鹽溶液平衡，溶出其中的雜蛋白。目前十六頁\總數(shù)五十七頁\編于八點分部鹽析法目前十七頁\總數(shù)五十七頁\編于八點反抽提法(RNA聚合酶)目前十八頁\總數(shù)五十七頁\編于八點注意事項?“局部過濃”?溫度（室溫）?分離方法目前十九頁\總數(shù)五十七頁\編于八點第二節(jié)有機溶劑沉淀

(OrganicSolventPrecipitation)

?定義：向水溶液中加入一定量親水性的有機溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法。目前二十頁\總數(shù)五十七頁\編于八點一、基本原理1、降低了介質(zhì)的介電常數(shù)，使溶質(zhì)分子之間的靜電引力增加，聚集形成沉淀。2、水溶性有機溶劑本身的水合作用降低了自由水的濃度，壓縮了親水溶質(zhì)分子表面原有水化層的厚度，降低了它的親水性，導(dǎo)致脫水凝集。目前二十一頁\總數(shù)五十七頁\編于八點一些溶劑的介電常數(shù)目前二十二頁\總數(shù)五十七頁\編于八點?優(yōu)點：乙醇等有機溶劑易除去，產(chǎn)品更純凈；密度差較大，離心收集。?缺點：容易使蛋白質(zhì)變性，操作常需低溫，成本高，需防火防爆目前二十三頁\總數(shù)五十七頁\編于八點二、影響沉淀效果的因素（一）有機溶劑種類及用量常用的溶劑有乙醇、丙酮、甲醇等。（二）pH的影響許多蛋白質(zhì)在等電點附近時溶解度最低，溶液pH應(yīng)在等電點附近，還須考慮蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。目前二十四頁\總數(shù)五十七頁\編于八點（三）溫度（低溫沉淀）

有機溶劑存在下，大多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度降低而顯著地減小。（四）無機鹽的含量低鹽：有利于沉淀，還有保護(hù)蛋白質(zhì)，防止變性。高鹽：增大蛋白質(zhì)在有機溶劑―水溶液中的溶解度，沉淀物中可能夾帶鹽。目前二十五頁\總數(shù)五十七頁\編于八點（五）某些金屬離子的助沉淀作用

多價陽離子，如Ca2+、Zn2+能與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)溶解度降低。胰島素精制：目前二十六頁\總數(shù)五十七頁\編于八點（六）樣品濃度濃度小時，增加溶劑投入量和損耗。濃度大時，增加共沉作用，降低分辨率。蛋白質(zhì)濃度0.5%～2%；粘多糖濃度1%～2%。目前二十七頁\總數(shù)五十七頁\編于八點第三節(jié)其它沉淀方法一、等電點沉淀法對于兩性物質(zhì)，等電點時凈電荷為零，分子間排斥電位降低，吸引力增大，能相互聚集起來，發(fā)生沉淀。雜蛋白目前二十八頁\總數(shù)五十七頁\編于八點胰島素純化：

胰島素?pH8?除去堿性雜蛋白?pH3?除去酸性雜蛋白目前二十九頁\總數(shù)五十七頁\編于八點二、成鹽沉淀法金屬離子沉淀：與生物分子的酸性功能團(tuán)作用的金屬復(fù)合鹽法；有機酸類復(fù)合鹽沉淀:與生物分子的堿性功能團(tuán)作用的有機酸復(fù)合鹽法（如苦味酸鹽、苦酮酸鹽、丹寧酸鹽等）。目前三十頁\總數(shù)五十七頁\編于八點1．金屬離子沉淀：

Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Ca2+、Ba2+、Mg2+等；2．生成有機酸類復(fù)合鹽沉淀（1）丹寧即鞣酸（2）雷凡諾（3）三氯乙酸（TCA）目前三十一頁\總數(shù)五十七頁\編于八點目前三十二頁\總數(shù)五十七頁\編于八點目前三十三頁\總數(shù)五十七頁\編于八點三、親和沉淀利用親和反應(yīng)原理，將配基與可溶性的載體偶聯(lián)后形成載體-配基復(fù)合物（親和沉淀劑），該復(fù)合物可選擇性地與蛋白質(zhì)結(jié)合，在一定條件下沉淀出來。中性可溶，酸性沉淀。目前三十四頁\總數(shù)五十七頁\編于八點目前三十五頁\總數(shù)五十七頁\編于八點四、高分子聚合物沉淀水溶性非離子型高分子聚合物，如不同分子量的聚乙二醇（PEG）、葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯等，能使蛋白質(zhì)水合作用減弱而發(fā)生沉淀。五、表面活性劑十六烷基三甲基季胺溴化物（CTAB）十六烷基氯化吡啶（CPC）酸性多糖目前三十六頁\總數(shù)五十七頁\編于八點目前三十七頁\總數(shù)五十七頁\編于八點六、選擇性變性沉淀法?熱變性沉淀法?酸堿變性沉淀法?利用試劑（氯仿）目前三十八頁\總數(shù)五十七頁\編于八點固相析出分離法?第一節(jié)鹽析法?第二節(jié)有機溶劑沉淀?第三節(jié)其它沉淀方法

一、等電點沉淀法二、成鹽沉淀法目前三十九頁\總數(shù)五十七頁\編于八點第四節(jié)結(jié)晶(crystallization)?定義：溶液中的溶質(zhì)在一定條件下因分子有規(guī)則的排列而結(jié)合成晶體。?通過結(jié)晶，溶液中的大部分雜質(zhì)會留在母液中，經(jīng)過濾、洗滌可得到純度高的晶體。目前四十頁\總數(shù)五十七頁\編于八點一、結(jié)晶過程指溶質(zhì)自動從過飽和溶液中析出形成新相的過程。C2—小晶體的溶解度；C1—普通晶體的溶解度；ρ—晶體密度；M—晶體質(zhì)量；σ—晶體與溶液間的界面張力；γ2—小晶體的半徑；γ1—普通晶體的半徑；目前四十一頁\總數(shù)五十七頁\編于八點結(jié)晶包括三個過程：(1)形成過飽和溶液;(2)晶核形成;(3)晶體生長。目前四十二頁\總數(shù)五十七頁\編于八點濃度溫度圖目前四十三頁\總數(shù)五十七頁\編于八點二、過飽和溶液的形成(結(jié)晶方法)（一）、蒸發(fā)法（二）、溫度誘導(dǎo)法熱盒技術(shù)（三）、鹽析結(jié)晶法（四）、透析結(jié)晶法（五）、有機溶劑結(jié)晶法目前四十四頁\總數(shù)五十七頁\編于八點溫度誘導(dǎo)法目前四十五頁\總數(shù)五十七頁\編于八點鹽析結(jié)晶法目前四十六頁\總數(shù)五十七頁\編于八點透析結(jié)晶法目前四十七頁\總數(shù)五十七頁\編于八點（六）、等電點法（七）、微量擴(kuò)散法（八）、化學(xué)反應(yīng)結(jié)晶法調(diào)節(jié)溶液的pH或向溶液中加入反應(yīng)劑，成新物質(zhì)，結(jié)晶析出。（九）、共沸蒸餾結(jié)晶目前四十八頁\總數(shù)五十七頁\編于八點等電點法目前四十九頁\總數(shù)五十七頁\編于八點化學(xué)反應(yīng)結(jié)晶法目前五十頁\總數(shù)五十七頁\編于八點綜合利用目前五十一頁\總數(shù)五十七頁\編于八點三、提高晶體質(zhì)量的途徑工業(yè)上通常希望得到粗大而均勻的晶體，便于過濾與洗滌。（一）、晶體大小影響晶體大小的主要因素有過飽和度、溫度、攪拌速度、晶種等。目前五十二頁\總數(shù)五十七頁\編于八點晶種目前五十三頁\總數(shù)五十七頁\編于八點（二）、晶體形狀改變晶體外形，可用:選擇不同的溶劑、控制過飽和度、結(jié)晶溫度、調(diào)節(jié)溶液的pH和有目的地加入某種能改變晶形的雜質(zhì)等。（三）、晶體純度晶體表面具有一定的物理吸附能力。重結(jié)晶：即將晶體用合適的溶劑溶解再次結(jié)晶。目前五十四頁\總數(shù)五十七頁\編于八點重結(jié)晶(recrystallization)?溶解度受溫度影響較大的物質(zhì)，將產(chǎn)品溶解在熱的溶劑中，緩慢降低溫度析出晶體。?將溶質(zhì)溶于一種溶劑中，然后將第二種溶劑加熱后緩緩地加入，放置一段時間使結(jié)晶完全。目前五十五頁\總數(shù)五十七頁\編于八點紅霉素重結(jié)晶用于生物物質(zhì)重結(jié)晶的溶劑一般有蒸餾水、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、低級醇等。目前五十六頁\總數(shù)五十七頁\編于八點第五章1、鹽析沉