酶切回收連接第1頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四質(zhì)粒DNA的酶切第2頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四定義：識別dsDNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。限制性核酸內(nèi)切酶第3頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四Ⅱ類內(nèi)切酶作用特點能在特殊位點識別和切斷dsDNA，識別序列4-6bp，具有回文結(jié)構(gòu)（180度旋轉(zhuǎn)對稱結(jié)構(gòu)）HindⅢ產(chǎn)生5'粘性末端AAGCTTTTCGAAAAGCTTTTCGAA第4頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四SstⅠGAGCTCCTCGAG產(chǎn)生3'粘性末端GAGCTCC

TCGAG粘端切口第5頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四GTCCAGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口第6頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。3、命名：HindⅢ

Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶屬

系

株序書寫方法：前3個字母斜體第7頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四酶活性單位指在限定條件下（溫度、Buffer），1hr消化1ugDNA的酶量稱為一個酶單位（unit）。實際工作中，為保證消化完全，1ugDNA的消化需要3-5個單位的酶，反應(yīng)時間也要適度延長，通常是反應(yīng)過夜。第8頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四酶切反應(yīng)系統(tǒng)的設(shè)計回收DNA通常酶切10μg實際酶的用量應(yīng)是理論用量的3-5倍。酶通常保存在50%的甘油中，使用時甘油濃度必須小于5%，故酶至少稀釋10倍。Buffer通常是10×，使用時稀釋10倍?？偡磻?yīng)體積20-50ul，不足用tdH2O補足。第9頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四DNA的量酶的用量（U/C）酶在50％甘油中，甘油在總體積的濃度要小于5％反應(yīng)的總體積Buffer的體積水的體積第10頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四質(zhì)粒DNA15μl（10μg）HindIII(20U/μl)

1.5μl10×緩沖液E3μl三蒸水9μl_____________________________________總體積

30μlXbaI（20U/μl1.5μl加樣順序加樣后混勻，短暫離心，使之至管底。第11頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四DNA片段的

分離純化第12頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四四、操作步驟：關(guān)鍵操作：點樣在加樣孔正上方，不要進入孔中甚至戳穿孔底加樣器一旦按下，就一定保持按住直至加樣器離開加樣孔，否則會將樣品又吸回到tip中，使加樣失敗第13頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四載體DNA目的基因第14頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四

bp—1534—994—695—515—377—237

ABCM

第15頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四酚抽提法切下含目的DNA的膠塊。加入酚，將膠塊沒過即可。振蕩后低溫凍結(jié)，視溫度而定時間。30℃水浴融化，若體積小，可補加TE。振蕩器上振蕩。12,000rpm離心5min。取上清200μl。第16頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四用200μl的氯仿：異戊醇抽提（振蕩，離心12000rpm，5min，取上清）。加20μlNaAc，400μl無水乙醇沉淀DNA，冰凍約30min甚至過夜。12,000rpm離心10min，棄上清。將DNA溶于約30μlTE中。第17頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四DNA片段的連接反應(yīng)第18頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四

DNA連接酶ligase催化DNA5'磷酸基與3'羥基之間形成磷酸二酯鍵(ATP)

5'5'3'3'OHPOHPDNA連接酶DNA連接酶第19頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四總體積20μl載體0.1~0.2μg目的基因：載體mol數(shù)=1～5：1H2O10×buffer載體目的基因ligase總體積20μlμlμlμl