生物技術(shù)及應(yīng)用專業(yè)教學(xué)資源庫溶血性鏈球菌檢驗(yàn)方法副溶血性弧菌Vibrioparahaemolyticus檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)壳案比苎曰【臋z驗(yàn)采用國標(biāo)法（GB/T4789.7—2013）設(shè)備和材料

除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：a)恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃；b)冰箱：2℃～5℃、7℃～10℃；c)恒溫水浴箱：36℃±1℃；d)均質(zhì)器或無菌乳缽；e)天平：感量0.1g；f)無菌試管：18mm×180mm、15mm×100mm；g)無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭；h)無菌錐形瓶：容量250mL、500mL、1000mL；i)無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm；j)全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)；k)無菌手術(shù)剪、鑷子。

培養(yǎng)基和試劑

3％氯化鈉堿性蛋白胨水、硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖（TCBS）瓊脂、3％氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂、3％氯化鈉三糖鐵瓊脂、嗜鹽性試驗(yàn)培養(yǎng)基、3％氯化鈉甘露醇試驗(yàn)培養(yǎng)基、3％氯化鈉賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基、3％氯化鈉MR-VP培養(yǎng)基、3％氯化鈉溶液、我妻氏血瓊脂、氧化酶試劑、革蘭氏染色液、ONPG試劑、Voges-Proskauer（V-P）試劑、弧菌顯色培養(yǎng)基、生化鑒定試劑盒。副溶血性弧菌檢驗(yàn)程序

1.樣品制備

冷凍樣品應(yīng)在45℃以下不超過15min或在2-5℃不超過18小時(shí)解凍。非冷凍而易腐蝕的樣品應(yīng)盡可能及時(shí)檢驗(yàn)，若不能及時(shí)檢驗(yàn)，應(yīng)置7-10℃冰箱保存，在24h內(nèi)檢驗(yàn)。魚類和頭足類動(dòng)物取表面組織、腸或鰓.貝類取全部內(nèi)容物,包括貝肉和體液,甲殼類取整個(gè)動(dòng)物，或者動(dòng)物的中心部分,包括腸和鰓。以無菌操作取檢樣25g（或ml），加人3％氯化鈉堿性蛋白棟水225ml，用旋轉(zhuǎn)刀片式均質(zhì)器以8000r/min取均質(zhì)1min，或拍擊式均質(zhì)器拍擊2min，制備成1：10的均勻稀釋液。如無均質(zhì)器，則將樣品放人無菌乳缽中磨碎，然后放500mL的滅菌容器內(nèi),加225ml3%氯化鈉堿性蛋白胨水，并充分振蕩。2、增菌（1）定性檢測將制備好的1:10樣品勻液于36℃±1℃培養(yǎng)8h～18h。（2）定量檢測用無菌吸管吸取1:10樣品勻液1mL，注入含有9mL3%氯化鈉堿性蛋白胨水的試管內(nèi)，振搖試管混勻，制備1:100的樣品勻液。另取1mL無菌吸管，按之前操作程序，依次制備10倍系列稀釋樣品勻液，每遞增稀釋一次，換用一支1mL無菌吸管。根據(jù)對檢樣污染情況的估計(jì)，選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種3支含9mL3%氯化鈉堿性蛋白胨水的試管，每管接種1mL。置36℃±1℃恒溫箱內(nèi)，培養(yǎng)8h～18h。

3.分離

a.對所有顯示生長的增菌液，用接種環(huán)在距離液面以下1cm內(nèi)沾取一環(huán)增菌液，于TCBS平板或弧菌顯色培養(yǎng)基平板上劃線分離。一支試管劃線一塊平板。于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。b.典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈圓形、半透明、表面光滑的綠色菌落，用接種環(huán)輕觸，有類似口香糖的質(zhì)感，直徑2mm～3mm。從培養(yǎng)箱取出TCBS平板后，應(yīng)盡快（不超過1h）挑取菌落或標(biāo)記要挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在弧菌顯色培養(yǎng)基上的特征按照產(chǎn)品說明進(jìn)行判定。4.純培養(yǎng)

挑取三個(gè)或以上可疑菌落，劃線3

％氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板，36

℃

土l

℃

培養(yǎng)18h--24h.5.初步鑒定

氧化酶試驗(yàn)

挑選純培養(yǎng)的單個(gè)菌落進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)，副溶血性弧菌為氧化酶陽性。涂片鏡檢

將可疑菌落涂片，進(jìn)行革蘭氏染色．鏡檢觀察形態(tài)。副溶血性弧菌為革蘭氏陰性，呈棒狀、弧狀、卵圓狀等多形態(tài)，無芽胞，有鞭毛.3﹪氯化鈉三糖鐵瓊脂

挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落，轉(zhuǎn)種3%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面并穿刺底層，36℃±1℃培養(yǎng)24h觀察結(jié)果。副溶血性弧菌在3%氯化鈉三糖鐵瓊脂中的反應(yīng)為底層變黃不變黑，無氣泡，斜面顏色不變或紅色加深。嗜鹽性實(shí)驗(yàn)6.確定鑒定取純培養(yǎng)物分別接種含3%氯化鈉的甘露醇試驗(yàn)培養(yǎng)基、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基、MR-VP

培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)24h～48h后觀察結(jié)果；3%氯化鈉三糖鐵瓊脂隔夜培養(yǎng)物進(jìn)行ONPG試驗(yàn)?？蛇x擇生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)。

ONPG試驗(yàn)β-半乳糖苷酶試驗(yàn)（ONPG試驗(yàn)）簡介（1）β-半乳糖苷酶試驗(yàn)原理：有的細(xì)菌可產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，能分解鄰-硝基酚-β-D-半乳糖苷（ONPG），而生成黃色的鄰-硝基酚，在很低濃度下也可檢出。（2）試劑：0.75MONPG溶液：取80mg溶于15ml蒸餾水中，在加入緩沖液（6.9gNaH2P04溶于45ml蒸餾水中，用30%NaOH調(diào)整pH為7.0，再加水至50ml）5ml，置4℃冰箱中保存。0NPG溶液為無色，如出現(xiàn)黃色，則不應(yīng)再用。（3）方法：從培養(yǎng)基上取菌，于0.25ml無菌生理鹽水中制成菌懸液，加入一滴甲苯并充分振搖，使酶釋放。將試管置37℃水浴5min，加入0.25mlONPG試劑，水浴20min～3h觀察結(jié)果。（4）結(jié)果：菌懸液呈現(xiàn)黃色為陽性反應(yīng)，一般在20～30min內(nèi)顯色。（5）應(yīng)用：迅速及遲緩分解乳糖的細(xì)菌ONPG試驗(yàn)為陽性，而不發(fā)酵乳糖的細(xì)菌為陰性。本實(shí)驗(yàn)主要用于遲緩發(fā)酵乳糖菌株的快速鑒定。API2OE生化鑒定試劑盒可在24小時(shí)內(nèi)鑒定革蘭陰性桿菌:108種不同的菌種或項(xiàng)(腸桿菌科、弧菌科、非發(fā)酵革蘭陰性桿菌)。API20E操作既快速又簡便，選取單個(gè)菌落，在試條及試條包裝袋上提示有操作過程，反應(yīng)的顏色變化清晰。

神奈川試驗(yàn)（選做項(xiàng)目）神奈川試驗(yàn)是在我妻氏瓊脂上測試是否存在特定溶血素。神奈川試驗(yàn)陽性結(jié)果與副溶血性弧菌分離株的致病性顯著相關(guān)。用接種環(huán)將測試菌株的3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂18h培養(yǎng)物點(diǎn)種于表面干燥的我妻氏血瓊脂平板。每個(gè)平板上可以環(huán)狀點(diǎn)種幾個(gè)菌。36℃±1℃培養(yǎng)不超過24h，并立即觀察。陽性結(jié)果為菌落周圍呈半透明環(huán)的β溶血。7.報(bào)告

根據(jù)檢出的可疑菌落生化性狀，報(bào)告25g