關(guān)于分子生物學(xué)常用技術(shù)第1頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月分子生物學(xué)常用技術(shù)凝膠電泳分子雜交聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)DNA的物理圖譜DNA序列測(cè)定基因芯片第2頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)凝膠電泳

(gelelectrophoresis)電泳概念基本原理Qμ＝

6πrη

μ:遷移率

Q:電荷量

r:粒子半徑（分子量）η:介質(zhì)粘度

第3頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月電泳的用途分離鑒定純度測(cè)定分子量凝膠電泳的種類瓊脂糖凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳

第4頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月一、瓊脂糖凝膠電泳

(agarosegelelectrophoresis)

分離核酸原理操作要點(diǎn)應(yīng)用范圍第5頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）分離核酸原理

電荷效應(yīng)

分子篩效應(yīng)

分子構(gòu)象第6頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月1.電荷效應(yīng)核酸是兩性電解質(zhì)

pH=3.5,正電荷pH=8.0~8.3

,負(fù)電荷，正極第7頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月第8頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月2.分子篩效應(yīng)小分子移動(dòng)快，大分子移動(dòng)慢第9頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月3.分子構(gòu)象閉環(huán)超螺旋>線狀DNA>開環(huán)DNA

+-第10頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）操作要點(diǎn)支持物凝膠濃度的選擇

DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)電泳緩沖液樣品制備電泳條件

DNA電泳染色

DNA片段的回收第11頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月1.支持物第12頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月商品化的瓊脂糖第13頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月瓊脂糖種類普通低熔點(diǎn)高純高篩分熔點(diǎn)80~90℃<70℃80~90℃80~90℃機(jī)械強(qiáng)度中差高高分辨率中差中高第14頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月2.凝膠濃度的選擇第15頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月凝膠的制備第16頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月第17頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月第18頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月3.DNAmarker第19頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月DNAmarker第20頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線第21頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月4.電泳緩沖液

Tris-乙酸(TAE)pH8.0

Tris-硼酸(TBE)

pH8.0

Tris-磷酸(TPE)pH8.0

第22頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月5.樣品制備上樣緩沖液50%甘油/蔗糖0.5%溴酚藍(lán)/二甲苯青

第23頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月點(diǎn)樣第24頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月6.電泳條件潛水電泳恒壓電泳

低壓:1~2V/cm

中壓:8~10V/cm

高壓電泳：>幾十V/cm溫度：15~25℃

第25頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月潛水電泳第26頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月7.電泳染色溴乙錠(ethidiumbromide,EB)

結(jié)構(gòu)及染色原理染色方法加入凝膠液中

電泳結(jié)束后染色第27頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月EB染色原理第28頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月第29頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月紫外燈下顯色第30頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月8.DNA片段的回收低熔點(diǎn)瓊脂糖法

透析袋電洗脫法(>5kb)DEAE-纖維素膜法(0.5~5kb)第31頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）應(yīng)用范圍

DNA的分離、純化和鑒定限制性酶切圖譜分析重組體的分離、鑒定雜交分析

PCR產(chǎn)物的分離鑒定第32頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月瓊脂糖凝膠電泳第33頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月二、聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE)

分離原理操作要點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用范圍第34頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）分離原理電荷效應(yīng)分子篩效應(yīng)第35頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月PAGE支持物單體－丙烯酰胺(Acr)

交聯(lián)劑－甲叉雙丙烯酰胺(Bis)

催化劑－過硫酸胺(AP)

加速劑－N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)第36頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月聚丙烯酰胺凝膠第37頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）操作要點(diǎn)凝膠的分類凝膠濃度的選擇凝膠液的配制凝膠中DNA的檢測(cè)DNA片段的回收第38頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月1.凝膠的分類非變性凝膠：dsDNA變性凝膠:ssDNA尿素甲酰胺SDS第39頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月2.凝膠濃度的選擇第40頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月第41頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月3.凝膠液的配制

試劑(ml)制備濃度(%)3.55.08.0122030%Acr11.616.626.640.066.6ddH2O67.762.752.739.312.75XTBE20.020.020.020.020.010%AP0.70.70.70.70.7TEMED35ul/100ml第42頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月PAGE裝置第43頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月第44頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月第45頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月第46頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月電泳第47頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月4.凝膠中DNA的檢測(cè)溴乙錠染色法

銀鹽染色法甲醛還原放射自顯影法Ag+－DNA

Ag（黑褐色）

第48頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月5.DNA片段的回收壓碎浸泡法<1kb

純度高，回收率低第49頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）PAGE優(yōu)點(diǎn)機(jī)械強(qiáng)度好、化學(xué)穩(wěn)定性高分辨率高載樣量大回收的DNA純度高

第50頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）PAGE應(yīng)用范圍分離、純化和鑒定RNA和小分子DNA

DNA序列分析

PCR產(chǎn)物鑒定蛋白質(zhì)的檢測(cè)和分析第51頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)分子雜交

分子雜交的基本原理固相支持物探針幾種常用雜交技術(shù)第52頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月一、分子雜交的基本原理核酸的變性和復(fù)性第53頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月分子雜交DNA-DNA第54頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA-RNA第55頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月雜交條件靶分子探針雜交袋雜交爐第56頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月雜交種類被檢核酸種類和方法原位雜交斑點(diǎn)雜交Southern雜交Northern雜交Western雜交反應(yīng)介質(zhì)液相雜交固相雜交()第57頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月二、固相支持物固相支持物的特性結(jié)合能力強(qiáng)不影響雜交反應(yīng)結(jié)合牢固非特異性吸附少機(jī)械性能良好

第58頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月固相支持物的種類硝酸纖維素濾膜(nitrocellulosefiltermembrane)

尼龍膜(nylonmembrane)第59頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月1.硝酸纖維素濾膜

特點(diǎn)吸附ssDNA和RNA

雜交信號(hào)本底低不足不適于重復(fù)雜交濾膜較脆不適于電轉(zhuǎn)移印跡法對(duì)DNA小片段(<200bp)結(jié)合能力弱第60頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月2.尼龍膜特點(diǎn)結(jié)合能力強(qiáng)

可反復(fù)雜交

韌性強(qiáng)

適于電轉(zhuǎn)移印跡法對(duì)DNA小片段(10bp)結(jié)合能力強(qiáng)不足雜交信號(hào)本底較高

第61頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月分子生物學(xué)考試時(shí)間：2005.1.11(晚7:00-9:00)地點(diǎn)9教講演廳(150人)9-2-1(50人)9-2-2(50人)9-3-1(50人)答疑：1.10(9:00-11:30;3:00-5:30)地點(diǎn)：逸夫樓3樓生化實(shí)驗(yàn)室第62頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月三、探針(probe)探針的概念探針的類型

標(biāo)記物的種類標(biāo)記方法第63頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月1.探針的概念特異結(jié)合和檢測(cè)靶分子的活性物質(zhì)抗原－抗體配體－受體同源DNA/RNA第64頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月2.探針的類型基因組DNA探針

cDNA探針

RNA探針寡核苷酸探針蛋白質(zhì)或多肽探針第65頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月3.標(biāo)記物的種類放射性同位素(32P,3H,35S,125I,14C)

非放射性標(biāo)記物生物素地高辛熒光素酶

第66頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月4.核酸探針的放射性標(biāo)記方法

DNA缺口平移標(biāo)記法隨機(jī)引物標(biāo)記法

DNA的5’末端標(biāo)記

第67頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月缺口翻譯特點(diǎn)均一標(biāo)記制備dsDNA探針第68頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月隨機(jī)引物標(biāo)記法(randompriming)

隨機(jī)引物6nt含有各種可能的排列順序特點(diǎn)放射比活性>缺口翻譯操作簡(jiǎn)便DNA/cDNA探針第69頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月第70頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA的5’末端標(biāo)記(5’endlabeling)

堿性磷酸酶＋T4多核苷酸激酶標(biāo)記原理制備寡核苷酸探針制備短的DNA/RNA探針

第71頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA的5’末端標(biāo)記第72頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月四、Southern雜交Southernblotting/DNAblotting1975年，EdwenSouthern等印跡(blotting):轉(zhuǎn)移

blot:aspotormark,esp.ofink

blotting

第73頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月1.印跡的方法

毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法

電轉(zhuǎn)移法

真空轉(zhuǎn)移法

第74頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法第75頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月電轉(zhuǎn)移法第76頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月真空轉(zhuǎn)移法第77頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月第78頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月2.Southern雜交的步驟第79頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月3.Southern雜交的應(yīng)用基因的定性及定量分析基因的酶切圖譜分析基因突變分析RFLP第80頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月五、Northern雜交

RNAblotting

步驟

總RNA/mRNA→變性電泳分離→轉(zhuǎn)移→雜交→放射自顯影/化學(xué)顯色

應(yīng)用檢測(cè)組織/細(xì)胞中mRNA的大小、量比較不同組織/細(xì)胞中基因的表達(dá)情況

第81頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月Northern雜交第82頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月六、Western雜交免疫印跡(immunoblotting)

SDS→轉(zhuǎn)移→蛋白－第一抗體→標(biāo)記的第二抗體(探針)→檢測(cè)

應(yīng)用蛋白質(zhì)的定性定量分析第83頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月第84頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月免疫印跡第85頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月

Southern,Northern&Western

待測(cè)物質(zhì)

支持物

探針

轉(zhuǎn)移方式Southern

DNANC單鏈核酸

毛細(xì)管/電/真空

Northern

RNANC/尼龍單鏈核酸

毛細(xì)管/電/真空

Western

蛋白質(zhì)NC/PVDF

抗體電轉(zhuǎn)移

第86頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月七、原位雜交

(insituhybridization)定義種類細(xì)胞內(nèi)原位雜交組織切片原位雜交

基本程序細(xì)胞/組織固定預(yù)雜交雜交沖洗雜交信號(hào)檢測(cè)分析結(jié)果

第87頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月組織切片第88頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月第89頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月八、斑點(diǎn)雜交

(dothybridization)

第90頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)PCR技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)PCR的發(fā)展簡(jiǎn)史PCR的基本原理和步驟PCR的影響因素PCR的種類PCR的應(yīng)用第91頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月一、PCR的發(fā)展簡(jiǎn)史1971年,Korana提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想1985年,Mullis等發(fā)明了PCR技術(shù)1988年,PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR儀第92頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月二、PCR的基本原理和步驟基本原理－DNA復(fù)制三個(gè)步驟變性(denaturation)

退火(annealing)

延伸(extension)

第93頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR的原理第94頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物cycle

12345n長(zhǎng)片段

246810短片段

002822長(zhǎng)＋短

21222324252n第95頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系10X擴(kuò)增緩沖液：10ul模板DNA:0.1~2ug

引物：各0.2~1umol/L4種dNTP:各200umol/LMg2+:1.5mmol/LTaqDNA聚合酶：2.5U總體積：100ul第96頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月第97頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月三、PCR的影響因素

模板引物

TaqDNA聚合酶

4種dNTP

Mg2+循環(huán)條件

第98頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月模板

DNARNAcDNA對(duì)模板的純度要求低第99頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月引物長(zhǎng)度：15～30nt

G+C含量：40~60%

堿基的隨機(jī)分布避免引物自身和引物之間的互補(bǔ)引物的3’端引物的5’端引物濃度：0.2~1umol/L

第100頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月TaqDNA聚合酶

2.5U/100ul

－20℃保存最后加

第101頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月底物4種dNTP

的濃度相等終濃度：200umol/L

第102頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月Mg2+

濃度:1.5～2.0mmol/L

過高:非特異擴(kuò)增

過低:反應(yīng)產(chǎn)物減少第103頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月循環(huán)條件變性溫度和時(shí)間:90~96℃,30~60s退火溫度和時(shí)間:40~60℃,30~60sTm=4(G+C)+2(A+T)

延伸溫度和時(shí)間70～75℃(72℃)<1kb,1min;3～4kb,3～4min;10kb,15min循環(huán)次數(shù):25～35

第104頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月四、PCR的種類反轉(zhuǎn)錄PCR原位PCR(insituPCR)實(shí)時(shí)PCR(realtimePCR)重組PCR(recombinantPCR)錨定PCR(anchoredPCR)反向PCR(inversePCR)第105頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月原位PCR原位雜交＋PCR程序固定細(xì)胞/組織樣品→PCR前處理→PCR擴(kuò)增→原位雜交及檢測(cè)

第106頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)時(shí)PCR的原理第107頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月五、PCR的應(yīng)用分子生物學(xué)研究臨床醫(yī)學(xué)第108頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月分子生物學(xué)研究基因克隆

DNA序列測(cè)定基因的體外定點(diǎn)突變

突變分析(PCR-SSCP)

基因定量

第109頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月臨床醫(yī)學(xué)病原體診斷

遺傳病的基因診斷

腫瘤檢測(cè)

法醫(yī)學(xué)

第110頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)DNA序列測(cè)定

Sanger雙脫氧鏈終止法(1977)

Maxam-Gilbert化學(xué)裂解法(1977)第111頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月Sanger雙脫氧鏈終止法原理－DNA復(fù)制

反應(yīng)條件模板引物

dNTP（其中一種帶放射性標(biāo)記）

ddNTP

DNA聚合酶第112頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA的復(fù)制第113頁，課件共130頁，創(chuàng)作于2023年2