第五章實驗中的樣本制備詳解演示文稿目前一頁\總數(shù)八十頁\編于十七點優(yōu)選第五章實驗中的樣本制備目前二頁\總數(shù)八十頁\編于十七點但由于傳統(tǒng)的核酸提取方法常涉及去垢劑裂解、蛋白酶處理、有機溶劑提取及乙醇沉淀等步驟，不但繁瑣，而且增加了環(huán)境因素對標本以及標本間相互污染的機會，不但在RNA檢測時，易出現(xiàn)假陰性，而且當使用極為敏感的聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）及體外轉(zhuǎn)錄擴增系統(tǒng)檢測時，易得到假陽性結(jié)果。目前三頁\總數(shù)八十頁\編于十七點同時，由于這些方法要用到一些揮發(fā)性的有機溶劑，故對實驗操作人員的身體健康有一定的影響。因此，簡單而又高效且無需使用酚和氯仿的核酸提取方法對上述敏感的基因擴增檢測技術(shù)的廣泛應(yīng)用有重要意義。目前四頁\總數(shù)八十頁\編于十七點此外，標本的處理及保存對DNA和RNA（尤其是RNA）的影響較大，因此，在核酸測定時，樣本的處理及保存，對保證測定的準確有效尤為重要。臨床基因擴增檢驗中常涉及的標本有血清（漿）、全血、外周血單個核細胞、分泌物、拭子、膿、體液、石蠟切片、新鮮組織等，這些臨床標本的處理和保存方法各有不同。目前五頁\總數(shù)八十頁\編于十七點第一節(jié)臨床標本的處理和保存

血清（漿）標本目前六頁\總數(shù)八十頁\編于十七點在某些病原體如乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus,HCV）和人免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus,HIV）等的PCR臨床測定中，標本的獲取和保存，對于DNA測定，可能按照一般的血清標本處理程序，對測定影響不大，目前七頁\總數(shù)八十頁\編于十七點但對于RNA測定，標本的獲取和保存方式對測定結(jié)果，可能有決定性影響。有研究表明，用于RNA測定最好是使用EDTA抗凝（嚴禁使用肝素，因其對PCR擴增有抑制，且很難在核酸提取過程中完全去除）全血標本，抗凝后6小時內(nèi)分離血漿，如使用血清標本，則需盡快（2小時內(nèi)）分離血清，標本的短期（1-2周）保存可在-20℃下，較長期保存應(yīng)在-70℃。目前八頁\總數(shù)八十頁\編于十七點

以全血作為待測標本時，必須注意抗凝劑的選擇，一般使用EDTA-Na2或枸櫞酸鈉，不可使用肝素。全血樣本如用于DNA提取檢測，可4℃下短期保存，如用于RNA檢測，則應(yīng)在取血后，盡快提取RNA全血標本目前九頁\總數(shù)八十頁\編于十七點

外周血單個核細胞可從抗凝全血制備，主要有兩條途徑，一是使用淋巴細胞分離液分離制備；二是使用紅細胞裂解液，裂解全血中的紅細胞，經(jīng)生理鹽水數(shù)次洗滌，即可得到單個核細胞。外周血單個核細胞如暫不得取核酸，可保存于-70℃下。外周血單個核細胞目前十頁\總數(shù)八十頁\編于十七點

痰屬于分泌物，臨床上常用作為結(jié)核分枝桿菌DNA測定標本。由于痰標本中含有大量粘蛋白和雜質(zhì)，故在核酸提取時，需對標本進行初步處理，即用1mol/LNaOH液化。痰目前十一頁\總數(shù)八十頁\編于十七點需注意的是，液化時不能加熱，液化時間不能過長，液化標本如不立即用于核酸提取，可保存于-70℃下。此外，如用于非結(jié)核分枝桿菌如肺炎支原體的PCR檢測，痰標本只能室溫懸浮于生理鹽水中，充分振蕩混勻，促使大塊粘狀物下沉，取上清離心，所得到的沉淀物即可用于核酸提取。目前十二頁\總數(shù)八十頁\編于十七點在使用PCR方法檢測性病病原體時，臨床標本一般為棉拭子，可將棉拭子置于適量生理鹽水中，充分震蕩洗滌后，室溫靜置5-10分鐘，待大塊狀物下沉后，取上清立即離心，其后的沉淀即可用于DNA提取，如不立即用于核酸提取，則需保存于-70℃下。棉拭子目前十三頁\總數(shù)八十頁\編于十七點膿液的處理依情況而定，如用于分枝桿菌（如結(jié)核分枝桿菌）核酸測定的標本，粘稠的膿液可采用痰標本的處理模式，先進行液化，再離心取沉淀提取DNA；水樣的膿液則直接離心，沉淀用生理鹽水洗2-3次后，即可用于DNA提取。膿液目前十四頁\總數(shù)八十頁\編于十七點對于用于非分枝桿菌測定的膿液標本，如過于粘稠，則加入適量生理鹽水，充分振蕩后，靜置，取上清立即離心，沉淀用于DNA提?。蝗鐬樗畼?，則按上述直接離心取沉淀即可。沉淀標本的保存條件同樣為-70℃。目前十五頁\總數(shù)八十頁\編于十七點臨床體液標本包括胸水，腹水，腦脊液，尿液等，可按水樣標本的方式離心取沉淀后，提取核酸。沉淀樣本的保存同上。體液目前十六頁\總數(shù)八十頁\編于十七點

組織有新鮮組織塊和石蠟切片。新鮮組織塊的處理步驟首先用生理鹽水洗兩次，然后將其搗碎或切碎，加入生理鹽水后劇烈震蕩混勻，離心，棄上清，再用蛋白酶K消化后提取核酸。組織目前十七頁\總數(shù)八十頁\編于十七點新鮮組織最好是保存于50%乙醇中，具體作法是，先用生理鹽水將組織洗一次，切成寬度小于1cm的小片，加入適量的生理鹽水，然后，邊搖邊加入無水乙醇至終濃度為50%，這樣固定的組織標本室溫下可保存數(shù)日，4℃可保存6年。目前十八頁\總數(shù)八十頁\編于十七點石蠟切片用于核酸提取，需先用辛烷或二甲苯脫蠟，再用蛋白酶K消化后即可進行DNA提取?？偠灾?，標本的收集及適當?shù)念A(yù)處理，對用于PCR測定的核酸模板的成功提取，具有決定性作用。在這里要著重強調(diào)的一點是，所有用于上述臨床標本收集的容器如試管或離心管，均應(yīng)使用前高壓滅菌。目前十九頁\總數(shù)八十頁\編于十七點其它標本尿液前列腺液尿道口分泌物陰道分泌物宮頸口粘液咽喉拭子、鼻腔分泌物糞便目前二十頁\總數(shù)八十頁\編于十七點第二節(jié)核酸的提取方法

一、DNA提取的經(jīng)典方法

DNA提取的經(jīng)典方法，即所謂的“酚-氯仿提取法”。這種方法提取的DNA純度高，效果好，缺點是較為繁瑣。方法如下：目前二十一頁\總數(shù)八十頁\編于十七點1．試劑

（1）蛋白酶K緩沖液：

50mmol/LKCl,

10-20mmol/LTris-HCl,

2.5mmol/LMgCl2,pH8.3,

1%laureth12(一種表面活性劑)

0.5%Tween20,

100ug/ml蛋白酶K。目前二十二頁\總數(shù)八十頁\編于十七點（2）飽和酚：市售酚經(jīng)重蒸餾后（如貯存，則于-20℃下，用前從冰箱取出，與室溫平衡后，68℃下使酚溶解），加入等體積的0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)磁力攪拌15分種移出上層水相；重復(fù)上述抽提過程，直至酚相的pH大于7.8，酚達到平衡最后一次取出液相后，目前二十三頁\總數(shù)八十頁\編于十七點加入0.1體積含有0.2%β-巰基乙醇的0.1mol/LTris–HCl(pH8.0)，這種形式的酚溶液可裝在不透光的瓶中并處于10mmol/LTris-HCl（Ph8.0）緩沖液層之下，可4℃下保存一個月。目前二十四頁\總數(shù)八十頁\編于十七點TE緩沖液10mmol/LTris-Cl,1mmol/LEDTA,pH7.5或8.0。目前二十五頁\總數(shù)八十頁\編于十七點2．提取步驟

1、臨床標本經(jīng)前處理后

加入蛋白酶K緩沖液

56℃溫育1小時

加入等體積飽和酚，充分振蕩混勻

目前二十六頁\總數(shù)八十頁\編于十七點

12000rpm離心5分種

取水相，加入等體積氯仿

混勻，12000rpm離心2分鐘

取水相，加1/10體積的3mol/L

NaAc和2倍體積的無水乙醇目前二十七頁\總數(shù)八十頁\編于十七點-20℃30分鐘或過夜

12000rpm離心10分種

棄上清，用預(yù)冷75%乙醇洗3次

干燥

取20μlTE或無菌去離子水懸浮

4℃?zhèn)溆?/p>

目前二十八頁\總數(shù)八十頁\編于十七點二、RNA的提取

RNA的提取條件較DNA要求嚴格，主要是因為臨床標本及實驗室環(huán)境中，存在大量對RNA具有強烈降解作用的RNase較耐高溫，不易失活。因此在提取RNA時，如何避免RNase對標本的污染及防止RNase對提取的RNA的降解，是保證RNA成功提取的關(guān)鍵所在。目前二十九頁\總數(shù)八十頁\編于十七點（一）RNA提取所用器皿的處

理及溶液的準備

經(jīng)高壓滅菌的一次性使用的塑料制品如試管，離心管等基本上無RNase，可以不經(jīng)預(yù)處理直接用于制備和貯存RNA，實驗室用的普通玻璃器皿經(jīng)常有RNase污染，使用前必須于180℃干烤8小時以上，或用0.1焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制備RNA的燒杯，試管和其它用品。目前三十頁\總數(shù)八十頁\編于十七點DEPC是RNase的強烈抑制劑。灌滿DEPC的器皿于37℃下放置2小時，然后用滅菌水淋洗數(shù)次，并于100℃干烤15分鐘，最后高壓蒸汽下15分鐘。上述處理可除去器皿上良量的DEPC，以防DEPC通過羧甲基化作用對RNA的嘌呤堿基進行修飾。目前三十一頁\總數(shù)八十頁\編于十七點要注意的是，DEPC有致癌性，操作時須小心。對于RNA提取所需溶液的配制，必須用高壓滅菌的水和RNA研究專用的化學試劑配制溶液，用干烤過的藥匙稱取試劑，將溶液裝入無RNase的玻璃器皿。目前三十二頁\總數(shù)八十頁\編于十七點可能的話，溶液均應(yīng)用0.1%DEPC于37℃至少處理12小時,然后于100℃加熱15分鐘或高壓蒸汽滅菌15分鐘.須注意的是,DEPC可與胺類迅速發(fā)生化學反應(yīng),因此不能用來處理含有Tris一類的緩沖液,因此可存幾瓶新的,未開封的Tris試劑以制備無RNase的溶液.目前三十三頁\總數(shù)八十頁\編于十七點（二）RNA提取中RNase污染的控制

實驗操作人員的手是RNase污染最主要的潛在來源。因此，在準備用于RNA純化的實驗材料和溶液時，以及在涉及RNA的整個提取操作過程中，都應(yīng)戴一次性手套。目前三十四頁\總數(shù)八十頁\編于十七點實驗中，如觸摸“臟的”玻璃器皿和其它物品以后手套就可能會沾染上RNase，因此在RNA提取實驗中，應(yīng)勤換手套。常用的RNase抑制劑有以下幾種：目前三十五頁\總數(shù)八十頁\編于十七點1．RNase的蛋白質(zhì)抑制劑這種RNase的蛋白質(zhì)抑制劑是從人胎盤分離得到，可與多種RNase以非共價方式緊密結(jié)合，從而使RNase失活。其可置于含5mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）的50%甘油中，貯存于-20℃。目前三十六頁\總數(shù)八十頁\編于十七點2．釩核糖核苷復(fù)合物這種復(fù)合物由氧釩（IV）離子和4種核糖核苷之中的任一種所組成，能與多種RNase結(jié)合，并幾乎能百分之百地抑制RNase的活性。目前三十七頁\總數(shù)八十頁\編于十七點3．硅藻土硅藻土是一種粘土，通過吸附RNase而去除其降解RNA的作用。目前三十八頁\總數(shù)八十頁\編于十七點（三）RNA提取方法

RNA提取的常用方法有：（1）表面活性劑加蛋白酶K，氯仿-酚抽提法；（2）胍鹽提取結(jié)合氯仿-酚抽提法；（3）胍鹽提取結(jié)合玻璃粉、二氧化硅等顆粒懸浮吸附法等。目前三十九頁\總數(shù)八十頁\編于十七點第一種方法所提取的RNA純度高，反轉(zhuǎn)錄（RT）-PCR擴增的特異性好，缺點是操作繁瑣，易造成微量標本的丟失或標本間的交叉污染，還易因RNA降解而影響測定結(jié)果的可靠性及敏感性；目前四十頁\總數(shù)八十頁\編于十七點第三種方法較為方便省時，不需氯仿-酚抽提，但對玻璃粉、二氧化硅等的質(zhì)量有要求；第二種方法雖較為復(fù)雜，但結(jié)果穩(wěn)定性最優(yōu)，因為使用強烈變性劑加鹽酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白質(zhì)，導致細胞結(jié)構(gòu)破碎，核蛋白由于其二級結(jié)構(gòu)的破環(huán)而從核酸上解離下來。目前四十一頁\總數(shù)八十頁\編于十七點RNase可耐受多種處理（例如煮沸）而不失活，但卻會被4mol/L硫氰酸胍和β-巰基乙醇等還原劑所滅活，因此可聯(lián)用上述試劑從組織中提取完整無損的RNA。下面以血清（漿）的異硫氰酸胍（GuSCN）結(jié)合氯仿-酚說明RNA常用提取方法。目前四十二頁\總數(shù)八十頁\編于十七點異硫氰酸胍（GuSCN）結(jié)合氯仿-酚提取法異硫氰酸胍（GuSCN）結(jié)合氯仿-酚提取法目前四十三頁\總數(shù)八十頁\編于十七點（1）試劑

20%PEG6000

裂解液：

4mol/LGuSCN,

25mmol/L檸檬酸鈉pH7.0,

0.5%Sarkosyl（十二烷基肌酸鈉）

100mmol/Lβ-巰基乙醇

飽和酚：氯仿：異戊醇（50：49：1）3mol/LNaAcPH5.2

無水乙醇

75%乙醇

DEPC處理的無菌去離子水

RNasin（RNA酶抑制劑）目前四十四頁\總數(shù)八十頁\編于十七點（2）操作步驟

200μl血清（漿）

加入200μl20%PEG6000

4℃3小時，12000rpm離心15分鐘（4℃），棄上清

加入500μl裂解液混勻

目前四十五頁\總數(shù)八十頁\編于十七點加入50μlNaAc、500μl飽和酚：

氯仿:異戊醇溶液

混勻，冰浴10分鐘

4℃12000rpm離心5分鐘

取上層水相再用氯仿-異戊醇抽提一次

加入1/10體積NaAc溶液、2.5體積無水乙醇

冰浴30-60分鐘

目前四十六頁\總數(shù)八十頁\編于十七點4℃14000rpm離心10分鐘

棄上清

沉淀用75%乙醇洗一次

烘干或真空干燥

用10μlDEPC處理水溶解，加入2uRNasin

-20℃保存?zhèn)溆?/p>

目前四十七頁\總數(shù)八十頁\編于十七點三、核酸提取的改良方法

（一）旋轉(zhuǎn)離心柱（SPINCOLUMN）提取目前四十八頁\總數(shù)八十頁\編于十七點旋轉(zhuǎn)離心（SPINCOLUMN）技術(shù)是從生物樣品中分離純化微量核酸的較為簡便的方法，屬于硅吸附方法的一種。是美國和歐洲的科學家們從20世紀80年代未起開始研制的一種微量快速的核酸分離純化方法，目前四十九頁\總數(shù)八十頁\編于十七點其克服了傳統(tǒng)核酸純化方法的缺陷，適合于現(xiàn)代分子生物學工作需要進行大量微量核酸分離純化的工作特點。在美國，旋轉(zhuǎn)離心柱技術(shù)出現(xiàn)在90年代初，以后逐漸被市場和技術(shù)工作人員所接受，成為微量核酸分離純化的主導技術(shù)。目前五十頁\總數(shù)八十頁\編于十七點旋轉(zhuǎn)離心柱技術(shù)能夠快速、簡便地從生物樣品中分離純化包括人體DNA、質(zhì)粒DNA、總RNA、mRNA在內(nèi)的各類脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）大分子。盡管在市場上所見到旋轉(zhuǎn)離心柱各有特色，但是在原理上現(xiàn)行的旋轉(zhuǎn)離心柱系統(tǒng)通?？煞譃槿齻€部分：目前五十一頁\總數(shù)八十頁\編于十七點第一部分是利用裂解液促使細胞破碎，使細胞中的核酸釋放出來；第二部分是把釋放的核酸特異地吸附在特定的硅載體上，當然這種載體只對核酸有較強的親和力和吸附力而對其它的生化組分如蛋白質(zhì)、多糖、脂類則不相親和也不吸附；第三部分是把吸附在特定載體上的核酸洗脫下來，從而得到純化的核酸。目前五十二頁\總數(shù)八十頁\編于十七點旋轉(zhuǎn)離心柱技術(shù)的一次操作過程一般在10分鐘到20分鐘不等，比傳統(tǒng)純化方法的操作時間（幾個小時）大大減少。旋轉(zhuǎn)離心柱純化的DNA產(chǎn)物的OD260/OD280一般在1.80-2.00之間；分離純化效率在80%-100%之間。目前，旋轉(zhuǎn)離心柱技術(shù)已廣泛應(yīng)用于細胞核DNA、細菌DNA、質(zhì)粒DNA、細胞MRNA、膠上DNA或RNA等核酸的純化目前五十三頁\總數(shù)八十頁\編于十七點核酸載體的膜化是旋轉(zhuǎn)離心柱技術(shù)工業(yè)化使用的重要基礎(chǔ)。隨著微量核酸分離純化技術(shù)的出現(xiàn)，操作的簡便性、穩(wěn)定性和重復(fù)性一直是圍繞核酸分離純化技術(shù)應(yīng)用的核心問題。為了推出簡便、穩(wěn)定和重復(fù)性好的旋轉(zhuǎn)離心柱產(chǎn)品，旋轉(zhuǎn)離心柱技術(shù)中的核酸載體先后用過玻璃珠和藻膠等各種材料，直至20世紀90年代初才最后確定為人工膜。目前五十四頁\總數(shù)八十頁\編于十七點膜化后的旋轉(zhuǎn)離心柱產(chǎn)品具有操作簡便、穩(wěn)定、儲存方便、重復(fù)可靠等特點，成為核酸純化市場的主導產(chǎn)品。目前五十五頁\總數(shù)八十頁\編于十七點旋轉(zhuǎn)離心柱技術(shù)的適用性很廣，可用于全血、抗凝血、血清、腦脊液、分泌物、唾液、痰尿、糞便、軟骨、動植物組織等各種樣品的核酸提取。目前五十六頁\總數(shù)八十頁\編于十七點（二）玻璃粉吸附法

DNA或RNA可特異地吸附于玻璃粉上，因此將玻璃粉懸液與臨床標本混勻、離心、洗滌玻璃沉淀，即可從玻璃粉上獲得純化的核酸。目前五十七頁\總數(shù)八十頁\編于十七點Yamada等為簡化使用PCR檢測病原體的核酸提取方法，使用玻璃粉懸液直接從人外周血單個核細胞（PBMC）和血漿中提取核酸，這樣得到的核酸標本用于DNA和RNA的擴增檢測，得到滿意的結(jié)果。其提取方法分述如下：目前五十八頁\總數(shù)八十頁\編于十七點1．從細胞提取核酸

試劑

1%SDS（含10mmol/LEDTA）

4mol/LNaCl

玻璃粉懸液

乙醇洗滌（50%乙醇，10mol/LTris,pH7.4,1mol/LEDTA,50mmol/LNaCl）目前五十九頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(2)操作步驟

人外周血單個核細胞（PBMC）（2×105）

加入50μl1%SDS（含10mmol/LEDTA）

加入150μl4mol/LNaCl及50μl玻璃粉懸液混勻，置冰浴5分鐘

10000rpm離心1分鐘，傾去上清液

目前六十頁\總數(shù)八十頁\編于十七點用300μl乙醇洗滌液洗沉淀物3次

加入100μl水

3分鐘洗脫DNA，離心

上清液即為含純化DNA的核酸標本目前六十一頁\總數(shù)八十頁\編于十七點2．從血清（漿）中提取用于RNA檢測的核酸

（1）試劑

6mol/LGuSCN

玻璃粉懸液

無水乙醇

目前六十二頁\總數(shù)八十頁\編于十七點2）操作步驟

200μl血清（漿）

加入200μl6M異硫氰酸胍及20μl玻璃粉懸液

室溫90分鐘

10000rpm離心1分鐘，棄上清液

沉淀用300μl乙醇洗2次

沉淀物中加入50μl反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液，將RNA先轉(zhuǎn)錄為CDNA，再進行PCR上述核酸提取方法具有通用性，可用于任何其他病原微生物的核酸提取。目前六十三頁\總數(shù)八十頁\編于十七點（三）二氧化硅（SE）或

硅藻吸附法

除了玻璃粉以外，SE和硅藻（單細胞藻類的化石細胞壁，D）顆粒也具有特異吸附核酸的特性。Chaotropic試劑硫酸氰胍兼具細胞裂解及核酸失活兩種特性，因而在高濃度硫氰酸胍存在下，從細胞（包括細菌）或病毒顆粒中釋放出的核酸萬分可結(jié)合于SE或D顆粒上目前六十四頁\總數(shù)八十頁\編于十七點BOOM等利用硫氰酸胍和SE和D顆粒的上述特性，成功地從血清、尿液以及細胞中純化了DNA和RNA，可在不到1小時內(nèi)完成12個不同臨床標本的核酸提取工作，其有Y/SE和Y/D兩種提取方案，Y/SE方案為使用SE以提取血液和尿液等體液中的核酸；Y/D方案為使用D顆粒以提取細胞中的核酸。目前六十五頁\總數(shù)八十頁\編于十七點1、Y/SE方案

（1）試劑

裂解緩沖液L6：120gGUSCN溶于100ml0.1mol/LTris-HCl,PH6.4,然后加入0.2mol/LEDTA,PH8.0(用NaOH調(diào)節(jié))溶液22ml及2.6gTritonX-100.

洗滌緩沖液L2:120GGUSCN溶于100mL0.1mol/LTris-HCl,pH6.4,為使GUSCN溶解加快,可在60~65℃水浴下攪拌目前六十六頁\總數(shù)八十頁\編于十七點(2)操作步驟

50μl血清或尿液

加入900μl裂解緩沖液L6及40μlSE

立即旋轉(zhuǎn)混勻，5秒，室溫10分鐘

旋轉(zhuǎn)混勻5秒，離心（12000×g）15秒

用洗滌緩沖液L2將沉淀洗滌2次

目前六十七頁\總數(shù)八十頁\編于十七點再用70%乙醇洗2次，用丙酮洗1次

去掉丙酮，反應(yīng)管開蓋56℃干燥10分鐘

加入洗提緩沖液TE

混勻，56℃干燥10分鐘

12000×g離心2分鐘

上清液即含純化的核酸目前六十八頁\總數(shù)八十頁\編于十七點

使用上述Y/SE方案，可以從血清或尿液中高產(chǎn)量地（通常超過50%）提取單鏈、雙鏈、共價閉合或開環(huán)的DNA或RNA，其可作為限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄酶、大腸桿菌DNA多聚酶和TAQDNA多聚酶的良好基質(zhì)。目前六十九頁\總數(shù)八十頁\編于十七點該方案雖適用于病毒及革蘭陰性菌（如腦膜炎球菌、傷寒桿菌、淋球菌等）的基因組核酸提取，但不能直接從革蘭陽性菌（如金黃色葡萄球菌、鏈球菌或酵母菌等）中提取核酸，原因可能是由于硫氰酸胍不能很好的裂解革蘭陽性菌。目前七十頁\總數(shù)八十頁\編于十七點此外，在提取用于HBV-DNA檢測的血清核酸標本時，由于HBV-DNA的長負鏈5`未端共價結(jié)合有蛋白質(zhì)，而GUSCN不能將此蛋白從HBV-DNA上去掉，因此在上述提取方法中，由于有HBV-DNA結(jié)合蛋白的干擾，HBV-DNA難以從SE顆粒上洗脫下來。目前七十一頁\總數(shù)八十頁\編于十七點為解決此問題，作者對上述方法分別作了兩種改良，稱為H方案和Y*方案。H方案是首先用SDS-蛋白酶K處理血清，使HBV-DNA長負鏈5`未端蛋白脫落，然后再按上述方法提取。目前七十二頁\總數(shù)八十頁\編于十七點Y*方案是在用低鹽TE溶液從SE顆粒上洗脫HBV-DNA時，在TE溶液中加入蛋白酶K，使HBVDNA從SE上脫落下來。這兩